le choix dépend de l'équilibre entre la représentation des caractéristiques recherchées, la praticité logistique et les contraintes financières liées à son utilisation en tant que modèle pour des expériences scientifiques.
Définition
Transgenèse
La transgenèse consiste à ajouter, remplacer
ou inactiver un gène particulier de manière stable pour élucider les mécanismes qui gouvernent les fonctions biologiques. Cette modification doit passer les générations. Tout organisme-modèle possédant un génome peut subir une transgenèse.
Le choix d'un organisme modèle:
Les animaux utilisés en transgenèse:
- Chez les invertébrés:
- Drosophile :
- Génétique et embryogenèse.
- 12 jours/environ 100 individus.
- 50% de gènes homologues avec l'Homme.
- Utiles pour les dysfonctionnements protéiques.
- Nématode :
- Génétique, embryogenèse, vieillissement et neurobiologie.
- Faible nombre de cellules principalement dans le système digestif et nerveux.
- 80% des gènes homologues avec l'Homme. Utilisé pour des études sur l'apoptose.
- Chez les vertébrés:
- Poisson-zèbre :
- Génétique, pharmacologie et toxicologie.
- Proximité évolutive avec l'Homme,3 mois/100 individus.
- Idéal pour étudier le cœur et le système circulatoire.
- 70-85% de gènes homologues avec l'Homme.
- Souris :
- Modèle mammifère de référence, élevage peu coûteux.
- 3 mois/3 à 12 individus, durée de vie de 2 à 3 ans.
- 80% de gènes homologues avec l'Homme.
Générer une souris transgénique
- Principe:
-Addition d'un gène codant pour une protéine reportrice (GFP).
-Addition d'un gène d'intérêt (surexprimer une protéine).
-Suppression d'un gène d'intérêt (créer une déficience).
- Techniques de régénérescence:
- Micro-injection:
Méthode1: Transfert direct du gène dans les spermatides puis dans l'ovocyte de la femelle, suivi par le développement de l'œuf et l'implantation dans une femelle.
Méthode 2 : Transfert du gène dans les spermatogonies, réimplantation chez un autre mâle, récupération des spermatides pour l'implantation dans une femelle pseudo-gestante afin de produire des nouveau-nés transgéniques.
- Transfert de gènes via les cellules somatiques:
Prélèvement de cellules spécialisées et d'un ovocyte énucléé d'un individu différent de la même espèce. La fusion des deux cellules permet d'introduire le noyau de la cellule donneuse dans l'ovocyte énucléé, créant ainsi un embryon cloné. Après quelques jours de culture en laboratoire, l'embryon est réimplanté dans l'utérus d'une mère porteuse l'individu produit est génétiquement identique au donneur des cellules différenciées.
- Transfert via les cellules souches embryonnaires(ES):
Les cellules ES sont obtenues à partir de la masse interne d'un embryon au stade blastocyste, puis cultivées sur des cellules nourricières irradiées telles que des fibroblastes pour suspendre leur développement. Elles sont totipotentes, croissance illimitée, transférables. La transfection stable induit une intégration permanente de l'ADN transfecté dans le génome cellulaire, créant une altération génétique durable transmissible entre les générations. Cette méthode nécessite une sélection, comme la résistance à la néomycine, pour isoler les cellules transfectées stables.
Transfection des cellules embryonnaires:
- Transfection physique
- Transfection chimique
- Transfection biologique
A retenir :
Transfection physique:
- Micro-injection :introduire des composés à l'intérieur d'une cellule individuelle à l'aide d'une micro-aiguille très fine.
- L'électroporation: courant électrique, création pores dans la membrane cellulaire(méthode efficace/cellules primaires malgré son coût élevé/cellules en suspension /mortalité cellulaire).
- Sonoporation: ultrasons, déstabilisation de la membrane, formation de pores, transit de l'ADN.
- Magnetocfetion: nanoparticules magnétiques chargées + formant des complexes avec l'ADN, favorisant leur entrée dans les cellules par endocytose lorsqu'elles sont attirées vers la membrane cellulaire par un aimant. Rapide, efficace, facile à utiliser, la présence de sérum et biodégradable/cellules immobilisées, coûteuse.
Transfection chimique:
- Phosphate de calcium: Mélange ADN/calcium (un précipité), incubation dans un tampon salin (environnement approprié), le précipité s'ajoute aux ES en culture, endocytose/phagocytose des précipités.
- Lipides cationiques: composés constitués de trois parties : une tête chargée + pour se lier à l'ADN, des chaînes hydrophobes, et un espaceur entre ces deux éléments. Formation de liposomes chargés + à leur surface et autour de l'ADN = lipoplexe +(interagissant avec la membrane cellulaire, facilitant l'entrée de l'ADN).
- Liposomes: inclusion de l'ADN à l'intérieur d'un liposome= lipoplexe (vecteur de transfection), ADN est encapsulé et capté par la cellule, facilitant ainsi son transfert à l'intérieur de la cellule cible.
- Polymères cationiques: polyplexes + (ADN + Polyéthyleneimine PEI) qui vont interagir avec la membrane et faire entrer le transgène dans la cellule. Facilitation de l’endocytose, liaisons aux molécules des protéines afin d’augmenter l’efficacité de la transfection puis (le polyplexe va utiliser le fait que la transferrine possède des récepteurs membranaires à laquelle elle va s’associer afin de faire débuter l’endocytose).
Transfection biologique:
- Infection virale: les virus sont constitués d'une enveloppe virale comprenant des spicules composés des protéines gp120 et gp41. Ces virus contiennent une intégrase, une reverse transcriptase et une protéase. Leur génome présente deux régions non codantes, avec une séquence appelée Psi, essentielle pour l'encapsidation du virus dans la cellule hôte.
- Cycle de réplication d'un rétrovirus: Fusion de l'enveloppe virale avec la membrane de la cellule hôte.
Libération de l'ARN viral dans le cytoplasme cellulaire.
Rétrotranscription de l'ARN viral en ADN par la reverse transcriptase.
Intégration de l'ADN viral dans le génome de la cellule hôte.
Transcription et traduction de l'ADN viral pour produire de nouvelles particules virales.
Assemblage des nouveaux virions.
Libération des virions matures pour infecter de nouvelles cellules.
- Application à la génération de vecteurs viraux pour la transgenèse: utiliser les rétrovirus pour infecter d'autres cellules sans qu'ils puissent se répliquer dans les cellules productrices (suppression de Gal,Pol,Env).