rhabdomyocyte = cell très longue (plusieur mm voir cm)

taille noyau = 5µm

hématies = 7 5µm

si aspect fibreux sur photo = muscle

cellule prenant coloration = riche en protéine

cell sans coloration = tissus adipeux

Microscopie optique = max µm

Microscope électronique = max angstrom = 0.1 nm

virus = 120 nm

Bactérie = 1 µm

- Cellule musculaire = de l’ordre du micron

Coloration bleu trypan : permet de distinguer les cells mortes (cellule bleue = morte, cell décolorée = vivante)

culture ex vivo = maintient en survie les cells hors corps (ex : greffe)

agent fixateur : permet de figer à l’instant t l’échantillon et éviter des contaminations bactériennes ou l’autolyse

ex agent fixateur : formol, formaldéhyde, alcool (éthanol, méthanol), glutaraldéhyde

La fixation se fait par immersion dans l'agent fixateur

inclusion : pour que ce qu'on observe soit manipulable

Taille cellule : 3 à 10µm

Coupe parrafine = technique de ref, la + utiliser --> parfaite pour Mo

Partie term de l'intestin grêle en coupe parrafine : On voit bien la lumière et les différents tissus : un coloré et un plus clair + des villosités + tissus sanguins (veineux et artérielles) on ne voit pas très bien les noyaux

Trichrome de Masson : noyau pas très visible

Coupe en résine --> Pour ME

oxyde propylène = agent du milieu d'inclusion

Technique permettant des coupes fines (1µm) ou ultrafines (<1µm)

coupe en parrafine = coloration au trichrome de Masson (rose)

coupe en résine = coloration HE (+rose et +cher)

Coupe en congélation

Pas d'alcool

utilité alcool dans observartion = élimine des métabolites et fige les structures donc non utilisable pour analyse bio moléculaire

Cette technique permet l'observation des changements d’homéostasie métabolite et une meilleure préservation des propriétés antigéniques des protéines et de la conservation des lipides.

utilisation d'un agent cryoprotecteur (pour que l'eau dans les organes ne cristallise pas)

agent cryoprotecteur dans isopentate (-80°) lui même dans azote liquide (-190°) = enrobage

Qualité moins bonne

coupe au vibratome

préserve les propriétés antigéniques

Mo et ME

organe complet, tissus complet, coupe épaisse (50 à 500µm)

coloration au bleu de methylène

LES COLORANTS

Colorant acide rouge éosine : fixation au composé basique des celles (colo rose/rouge du cytoplasme)

L’hématoxyline : colorant basique se liant au AN --> colo bleu/ violet des noyaux

Ribosome (basique) se lie au ARNr (acide) --> beaucoup de ribosome bleuté dans cytoplasme

Coloration HES = Hématoxyline - Éosine – Safran : permet de décrire la dispo des cells

Coupe de foie pathogène : grosse tache incolore = foie stéatosé donc accumulation anormale de lipide

coloration des lipides à l'oeil red O : colo marron/ rouge

TRICHROME DE MASSON :

• composé de hématoxyline (noyau),
• rouge ponceau (cytoplasme) et colore en rouge vif les hématies
• vert lumière ou bleu d'aniline (collagène)

Violet de cresyl (= colo nissl)

pour tissus nerveux

basique donc fixe élement acide permettant la distinction de la substance grise (en colorant soma, ribosome, noyau) de la substance blanche (axone)

MAY-GRÜNWALD-GIESMA (MGG) : différenciation cells sanguine (Gr, plaquette, Gb)

erythrocyte : anuclée

leucocyte : noyau composé en 5 lobe --> typique des neutrophiles

ordre de grandeur : neutrophile (60%), leucocyte (20-30%), Monocytes (5-10%), Éosinophiles (5-10%), Basophiles (<1%).

II.B. HISTOCHIMIE

PAS = Coloration à l’acide périodique de Schiff 

macromolécule de reserve (ex : glycogène en rose rouge) ainsi que protéoglycanes, des glucides, le mucus.

Oh sucre transformer en aldehyde reperer par PAS (rouge)

Les hépatocytes stocke le glycogène

Partie apicale des cells du tube digestif : stockage de glycogène

Coloration de PERLS

colo au fer (rosée)

Ex coupe de foie : cells ayant une accumulation de fer --> pb d'anémie

II.C. HISTOENZYMOLOGIE

coupe de congélation : permet de garder une act enzymatique

but : localisée enzyme par son act pour connaitre son lieu d'expression pour savoir quel cells exprime quel enzyme

on peut utilisé du nitro bleu de tetrazolium (NBT)

IMMUNOHISTOLOGIE

en immunohisto on utilise es immunoglobulines de types G (IgG) = 2 chaine lourde + 2 chaine légère relié par pont SS + fragment cristallisable + fragment de liaison à l'antigène.

Ac polyclonaux = + sensible

Ac monoclonaux : spé d'un épitope pour un antigène donné. temps de génération + court donc moins coûteux

actine = protéine du cytosquelette se retrouvant dans toutes les cellules

Les moyens de révélations du complexe antigène-anticorps

IMMUNOFLUORESCENCE

ex : fluorescéine

fluorochrome = molécule émettant une lumière fluorescente sous l’action d’une molécule excitatrice. 

Couplage de l’Ac à une enzyme : - Fixation de la phosphatase alcaline sur un Ac. Si on lui donne du nitrobleu de tetrazolium elle va être capable de catalyser ce substrat en un produit bleu.

METHODE INDIRECTE

AC primaire fixé à enzyme lui même fixé à un AC secondaire couplé au fluorochrome pour être révelé

Les Ac doivent être d'espèce diff

Les mitochondrie communiquent avec le RE par des ponts d'ancrage via des protéines permettant le passage de ca+ et des échanges

diabète : augmentation de ces ponts d'ancrage

technique de PLA : on prend 2 AC spé d'1 prot de la mb mitochondriale et 1 prot de la mb du RE. Ensuite on rajoute un AC couplé à des nt. Si les nt sont distant à moins de 100nm, il font s'amplifier et induire des fluorescences.

HYBRIDATION IN SITU

iddentification des AN et leurs transcrit

on utilise des sondes nucléiques marquée complémentaire à l'AN. Généralement les sondes sont de type ADNsb (simple brin).

Pour marquer l'AN on le dénature (separe les doubles brin) puis on l'hybride avec la sonde contenant des fluorochromes.

• Hybridation radioactive :

- Utilisation de 2 composés radioactifs (ex phosphore 32 et tritium) puis révélation par autoradiographie.

- Avantage : sensibilité.

- Inconvénient : logistique (matériel, santé).

• Hybridation non radioactive :

- Marqueurs directs : fluorescéine (directement sur la thymidine).

- Marqueurs indirects : digoxigénine et anticorps anti-dioxigénine

La biotine : forte affinité avec streptavidine

Hybridation in situ = utile pour biopsie pour savoir si l'infection est virale en détectant l'ADN viral

Aussi utile pour la FISH (permet de mitose) donc permet de détecter des pathologie (ex : réaliser caryotype anormaux)

AUTORADIOGRAPHIE 

détecter et localiser le site de synthèse des mol biologiques et suivre leur cheminement

Principe : marquage radioactif (ex : d'un AN) -> ca s'appelle une brique élementaire. Celle ci sera integrée dans le site de synthèse donc va permettre de le localiser

ex : marquage avec du fucose qu'on donne à un rongeur. résultat de l'observation visible au MO et ME

Si on veut marquer l'ADN : on marque la thymine (et U pour l'ARN)

RESUME

histochimie : focus sur le produit de réaction

histoenzymiologie : focus sur l'enzyme effectuant la réaction

immunohistologie : ciblage d'une protéine

LES TECHNIQUES D’IMAGERIE

MO à contraste de phase inversé 

objectif en dessous de la platine

but : avoir diff de réfraction pour mieux iddentifier les structures

On peut voir les noyaux sans colo. Des halos sont visible (typique de ce microscope). Les dif état de div sont visible.

MO à contraste de phase interférentiel 

microscope inversé avec 2 sources lumineuse se croisant, permettant la suppression d'artefact en halo et de voir en relief

Permet l'étude de diff type de cells vivante mais d'un seul type.

Nécessite de la coloration

On peut rajouter des filtres sur les microscopes pour voir que certaine longueur d'onde

MET

faisceau d'électron dans une colonne sous vide

résolution = 50nm (observation ribosome, intérieur organite, détail nucléole etc)

taille/poid : plusieurs tonne et 3m

MEB

cells observable en 3D

résolution limitée à 20nm

Microscopie en champs proche

basée sur détection d'un signal entre une sonde et la surface d'un échantillon

On analyse le comportement quantique (donc d'électron) d'un échantillon par rapport à la sonde

permet la définition de l'échantillon

• Microscope à effet tunnel :

mesure le courant due au passage des électrons entre pointe fine et échantillon

inconvenient = travail sous vide

• Microscope à force atomique AFM :

sonde à pointe très forte (10aine de micron) avec levier flexible

permet de savoir la place occuper par l'échantillon dans son environnement en 3D

enregistrement de l'interaction entre atome

permet la visualisation en relief d'élément de l'ordre du subcellaire (Ex : collagène)

inconvénient : long, et les lames fixant les échantillons finissent par les détruire