Concernant l’amplification PCR :
L’amplification PCR d’une seule région d’ADN de 1000 paires de bases nécessite l’hybridation de deux amorces. En effet, les amorces s’hybrident sur l’ADN, de part et d’autre de la région à amplifier
Concernant les nucléases :
Elles clivent l’ADN au niveau de séquences palindromique qui sont des sites des restriction (c'est leur rôle de base)
Elles sont impliquées dans les mécanismes d’édition du génome comme par exemple : CRISP/Cas9 est une nucléase utilisée dans les techniques d’édition du génome
Les DNases et les RNases sont des endonucléases.
Concernant la technique de séquençage Sanger :
Cette technique repose sur une étape d’hybridation moléculaire.
Initialement la technique reposait sur l’utilisation de dNTPs radioactifs. Aujourd’hui ce sont des marqueurs fluorescents
L’étape de polymérisation s’arrête lors de l’ajout des ddNTPs.
Il s’agit de la technique de référence du séquençage des acides nucléiques. En effet, c'est la première à avoir été créée
Une ADN polymérase permet l’allongement du brin à partir de l’amorce.
Concernant les sondes nucléiques :
Les sondes nucléiques sont essentiellement des séquences d’AN (ADN / ARN)
Les amplifications PCR en temps réel reposent sur l’utilisation d’amorces pas de sondes nucléiques
L’analyse de marqueurs géniques dans les tests de paternité sur une amplification PCR basée sur l’utilisation d’amorces, pas de sondes
Des sondes nucléiques sont utilisées lorsque l’on réalise un diagnostic moléculaire basée sur le séquençage haut-débit d’un panel de gènes de prédisposition héréditaire aux cancers digestifs. En effet, ce diagnostic repose sur un séquençage NGS pour lequel on utilise des sondes pour aller chercher les exons
La méthode de séquençage de l’ADN selon la méthode de Sanger nécessite des amorces et non des sondes nucléiques.
Concernant la technique de PCR :
Il s’agit d’une amplification exponentielle de l’ADN
Elle nécessite deux amorces situées de part et d’autre de la région d’intérêt.
L’ADN polymérase thermostable permet la synthèse de 2 brins complémentaires, chacun suite à une des amorces fixées précédemment
Elle repose sur des cycles de température permettant les étapes de dénaturation, hybridation et élongation.
L’exploitation des données peut se faire en temps réel
Concernant l’extraction de l’ADN génomique :
L’étape de précipitation alcoolique permet d’obtenir une pelote d’ADN. En effet : « Précipiter à l’alcool pour provoquer un changement d’état de l’ADN qui passe sous forme solide, par addition d’un solvant comme l’éthanol et l’isopropanol. Forme de pelote d’ADN. »
La technique de référence repose sur une extraction phénol/formol.
les kits commercialisés permettent uniquement de réaliser des multiplex PCR et des hybridations via des sondes (et non des extractions sur colonnes)
Pour garantir un ARN de bonne qualité, on va observer 2 pics : le pic 28S doit toujours être supérieurs au pic 18S et la ligne de base ne doit pas posséder de bruit de fond. A partir de ces critères on va pouvoir établir un score RIN allant de 1 à 10. Il doit être supérieur à 7 pour une bonne qualité.
Un ratio DO 260nm (AN) / DO 280nm (protéines) supérieur à 1,7 est signe d’une déprotéinisation justement suffisante de l’échantillon d’ARN par l’étape, ce ratio doit être compris entre 1,7 et 2
Les mutations du génome humain :
On retrouve des mutations sur l’ensemble des 3,3 Md de bases du génome (donc pas seulement sur les régions codantes du génome)
les mitochondries ont un taux de mutation très élevé
Elles peuvent théoriquement toute être détectées par séquençage NGS, c’est même le but du NGS
une mutation peut tout aussi bien être une délétion, une insertion, une substitution nucléotidique
Elles sont présentes dans toutes le cellules nuclées d’un individu donné (en partant du principe que ce sont des mutations “héréditaires” et non “de novo”)
Concernant les variations de séquence du génome humain :
La plupart d’entre elles ne sont pas pathogènes. En effet, : il s’agit en général de polymorphisme qui sont des variations non pathogènes
L’amplification PCR est une technique de quantification qui sert à déterminer le niveau d’expression des gènes mais qui par son amplification permet l’utilisation de certaines méthodes d’analyse par la suite comme le séquençage selon SANGER. Elle ne permet donc pas en elle même de détecter toute les variations de séquence
Il est possible qu’une variation de séquence identifiée dans une cellule donnée ne soit pas retrouvée dans une autre cellule provenant du même patient. En effet, c’est le cas des mosaïques que l’on retrouve notamment avec des cellules cancéreuses donc avec mutation de sa séquence nucléotidique ou encore dans le microchimérisme fœtal / maternel
Les microsatellites sont des variations de séquences qui peuvent être utilisés comme marqueur géniques. En effet, ces marqueurs géniques servent entre autres à baliser le génome
Une simple substitution nucléotidique, identifiée au sein du génome humain, peut être responsable d’une maladie génétique. Par exemple, si cette substitution entraine l’apparition d’un codon stop empêchant la synthèse d’une protéine essentielle à l’organisme
les microlésions ne sont pas détectées par PCR
dans les phénomènes de cancérisation, certaines cellules vont voir leur séquence d’ADN subir une mutation (dans ce cas pathogène) néanmoins toutes les cellules ne présenteront pas cette mutation
Les microsatellites peuvent servir de « marqueur multi-allélique »
Le système CRIPSR/Cas9 :
Il existe de manière naturelle chez la bactérie lorsqu’elle se protège d’infections virales.
Il n'existe pas de manière naturelle chez l'humain
Il est utilisé pour modifier de façon précise des régions sélectionnées au sein d’un génome.
Il ne nécessite pas l’utilisation d’une nucléase car la nucléase est la protéine cas 9, déjà incluse dans le système CRIPSR/Cas9
La spécificité de son action est due à une protéine (la cas9)
Il représente une stratégie d’avenir dans le traitement des maladies génétiques
La technique d’hybridation in situ en Fluorescence (FISH) :
Nécessite une sonde
Est une technique d'analyse ciblée, à l'inverse de la M-FISH et de CGH array qui permettent une analyse globale
Permet de diagnostiquer une anomalie de nombre des chromosomes sur un noyau en interphase. En effet, il n'y a pas de nécessité de division cellulaire et on peut repérer une anomalie de chromosomes avec FISH, comme la trisomie 21 (analyse ciblée, il faut connaitre ce que l'on cherche, on ne verra pas une anomalie de chromosome que l'on ne cherchait pas)
la résolution de FISH est de 150kb donc il faut que l'anomalie soit supérieure à 150 kb pour être vue
Peut identifier une délétion subtélomérique invisible sur un caryotype. En effet, la résolution d'un caryotype est de 5 Mb donc on ne verra pas des anomalies qu'on peut voir avec FISH (résolution >150kb)
Les variations de séquence du génome humain :
certaines variations peuvent ne pas être pathogènes : ce sont des polymorphismes, exemples : les mutations silencieuses qui ne changent pas l’AA d’origine
Elles correspondent majoritairement à des substitutions nucléotidiques
Une variation de séquence donnée n’est pas forcément présente dans toutes les cellules de l’organisme. Par exemple les anomalies constitutionnelles en mosaïque où l’individu présente deux types de cellules qui constituent son organisme (normales ou avec mutation)
Elles peuvent être mises en évidence par une technique couplant séquençage selon la méthode Sanger, par séquençage haut débit (NGS) et électrophorèse capillaire entre autre.
Les SNP et les microsatellites sont des variations de séquences qui peuvent permettre d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans des maladies génétiques
Concernant le séquençage de l’ADN selon la méthode Sanger :
Il est couramment utilisé pour rechercher un variant pathogène précis au sein d’un exon donné, car permet une lecture précise de courtes régions.
Cette méthode n'est pas utilisé pour le dépistage de la trisomie 21, en effet, on utilise plutôt la FISH ou le caryotype pour ce dépistage.
Il est couramment utilisé pour la détection des principales variations pathogènes du gène EGFR. En effet, c'est une méthode de référence pour séquencer un seul gène ou exon
Il n'est pas utilisé pour séquencer la totalité du génome humain car cela mettrait trop de temps (environ 13 ans)
Il permet de détecter une simple substitution nucléotidique.
Concernant l’amplification PCR :
Elle permet l’études des microsatellites : en les dupliquant on évalue leur quantité
Elle peut être utilisé en pharmacogénétique, pour les tests de parentalité par exemple
Elle peut être utilisé pour le diagnostic de la covid 19 (la q-rtPCR)
Elle peut être quantitative.
Elle permet l’amplification exponentielle de région d’ADN d'un chromosome de l'ordre de 1000 nucléotides
Concernant les acides nucléiques nucléaires :
Leur extraction comprend une étape initiale de lyse cellulaire rendant l'ADN accessible.
La technique d’extraction de référence repose sur une extraction phénol/chloroforme
Un dosage spectrophotométrique permet de quantifier après extraction.
La qualité du matériel extrait conditionne le type d’analyse moléculaire qui sera réalisé.
L'ARN est un matériel plus fragile que l’ADN.
Concernant les techniques de biologie moléculaire :
Elles peuvent permettre de faire le diagnostic moléculaire de maladies infectieuses mais pas de maladie génétique
Elles peuvent permettre de réaliser des tests de paternité (Amplification PCR)
Elles peuvent permettre la production de protéines humaines recombinantes.
Elles permettent de diagnostiquer les infections virales mais pas les infections bactériennes
On peut séquencer la totalité du génome avec le WGS (Whole Genome Sequencing)
Concernant les ADN polymérases :
Elles permettent l’élongation dans le sens 5’→ 3’de l’ADN.
Elles ne permettent pas de réguler l'expression d'un gène
Elles nécessitent une amorce pour permettre la synthèse d’un brin d’ADN.
Concernant l’extraction de l’ARN :
La qualité de l’ADN et de l'ARN sont évaluée grâce au score RIN obtenu par bioanalyseur.
L’ARN précipité est dissout dans de l’eau RNAse free. (L’eau RNAse free est une eau sans enzyme capable de dégrader l’ARN).
La première étape de l’extraction nécessite une lyse des cellules pour accéder aux transcrits. La lyse des cellules est effectuée par des agents détergents qui participent aussi à la dissociation des nucléosomes
Les ARN totaux extraits sont composés majoritairement d’ARNr (80-85%), d’ARNt (15-20%) et minoritairement d’ARNm (1-5%). Soit la composition normale en ARN d’une cellule
L’ARN extrait est dosé majoritairement par spectrophotométrie. Il existe aussi la technique de fluorimétrie mais qui est moins répandue.
L’amplification PCR :
Cette technique nécessite l’utilisation d’une ADN polymérase afin de synthétiser des brins d’ADNc
Les amplicons ont une taille maximale de 500 à 1000 pb alors qu’un gène à une taille moyenne de 20 000 pb. La PCR ne semble pas adaptée pour séquencer des gènes dans leurs intégralité.
Par son côté répétitif, la PCR ne servira à rien pour étudier les microsatellites
Cette technique permet d’obtenir indirectement la séquence peptidique de l’intégralité d’une protéine donnée par analyse des amplicons par PCR
Cette technique permet d’amplifier de courtes régions du génome que l’on a préalablement sélectionnées. En effet, c’est le principe de la PCR : multiplier exponentiellement un fragment d’ADN donné.
Le séquençage capillaire selon la méthode de Sanger :
Ce n'est pas la méthode de séquençage la plus adapté pour séquencer la totalité du génome humain. En effet, la méthode la plus adaptée est le NGS pour séquencer la totalité du génome humain
Il nécessite l’utilisation de didéoxynucléotides de synthèse. En effet, cette méthode utilise des didésoxynucléotides triphosphates radiomarqué qui arrête la polymérisation quand ils sont utilisés.
Il nécessite une amorce mais pas de d’oligonucléotides de synthèse
Il est utilisé pour analyser de courtes régions du génome, de ce fait, il ne peut pas être utilisé pour la détection des trisomies
Il n'est pas utilisé pour la détection de nouveaux CNV. En effet, la méthode la plus adaptée est le NGS pour la détection de nouveaux CNV.
le séquençage selon la méthode Sanger est utilisé pour l’étude des microsatellites et des substitutions nucléotidiques.
La PCR :
La PCR est une méthode permettant d’amplifier des régions du génome, mais la longueur de la région à amplifier ne peut dépasser 50 kb
La mise en évidence des microsatellite passe bien par une amplification par PCR utilisant un couple d’amorces encadrant la région concernée mais leur étude se fait par séquençage capillaire (électrophorèse capillaire). Donc l'amplification PCR ne permet pas à elle seule, l'analyse de microsatellite.
La PCR est nécessaire si on souhaite séquencer une région du génome selon la méthode de Sanger. En effet, l'ADN à séquencer est amplifié au préalable par PCR, puis est rendu simple brin pardénaturation avant un séquençage selon la méthode Sanger (électrophorèse capillaire)
Les étapes de la PCR sont : Dénaturation se faisant à température élevée comprise entre 90 et 95 degrés. Le chauffage permet alors la rupture des liaisons H reliant les brins complémentaires l’un à l’autre ➔ obtention de molécules d’ADN simple brin. Hybridation des amorces (et non des ADN polymérases) sur l’ADN, de part et d’autre de la région à amplifier. Cette étape est réalisée à une température plus basse que la température des amorces. Elongation des nouveaux brins d’ADN (polymérisés dans le sens 5’ > 3’) par une ADN polymérase thermostable (Taq polymérase) qui a une action sous 68 - 72° C et qui va utiliser les dNTPs(désoxyribonucléosides triphosphates) libres du milieu réactionnel. Ce cycle est répété 30 à 40 fois avec une amplification exponentielle
LA PCR ne nécessite pas l’utilisation des didésoxyribonucléosides triphosphates. En effet, les ddNTPs sont utilisés pour le séquençage selon la méthode Sanger. La PCR utilise des dNTPs
L’amplification PCR :
La PCR est une technique qui nécesite l’utilisation de 2 amorces différentes pour chaque région à amplifier
La PCR est une des étapes à réaliser pour pouvoir déterminer la séquence d’un ARNm
La PCR est basée sur la répétition de cycle composés de 3 étapes : dénaturation, hybridation des amorces, élongation
La PCR peut permettre de déterminer le niveau d’expression d’un gêne donné grâce aux PCR en temps réel et PCR digitale
Les oligonucléotides de synthèse :
ce sont toujours des simples brins, mais ça peut être de l’ADN ou de l’ARN
Il sont utilisés pour hybridation moléculaire en temps que sonde ou pour amplification PCR et séquençage en temps qu’amorce
Peuvent être dégradé par des nucléases. En effet, les nucléases sont des enzymes capables de dégrader des acides nucléiques, donc même s’ils sont de synthèse
Ne sont pas présentes de façon naturelle au sein des organismes vivants. En effet, ils sont seulement de synthèse
Peuvent être utilisé comme sonde pour hybridation in situ
Peuvent être utilisé comme amorces lors de PCR ou séquencage.
