a. Régénération des axones

b. Modélisation des traumatismes crâniens.

c. Modélisation des troubles neurodégénératifs (Maladie de Parkinson) 

d. Étude du développement

• Étude des circuits neuronaux grâce à des marqueurs fluorescents (ex : GFP).
• Rôle du thalamus dans l’organisation neuronale corticale.

e. Modélisation des maladies infectieuses (Maladie à prions) 

Origine et contexte :

• Les tissus proviennent de l'hippocampe et du cortex temporal, deux régions cérébrales impliquées dans les crises épileptiques.

Méthodes :

1. Préparation du tissu : échantillons traités pour former des tranches viables (200-500 µm), et cultivées dans un milieu défini.
2. Observation de l’activité neuronale :

• L’activité spontanée (décharges de type intercritique) est enregistrée en temps réel.
• Cette activité reflète les propriétés spécifiques des tissus issus des patients, comme les comportements épileptiformes.

Applications :

1. Étude des pathologies humaines :

• Analyse des mécanismes sous-jacents à l’épilepsie, comme les décharges neuronales ou les perturbations des réseaux synaptiques.
• Exploration de l’effet des traitements sur l’activité neuronale.

1. Recherche pharmacologique :

• Test de nouveaux médicaments directement sur des tissus humains, permettant un criblage plus précis et personnalisé.

Origine et préparation :

1. Les tissus pulmonaires utilisés proviennent généralement d’animaux adultes.
2. Les poumons sont gonflés avec de l’agarose (à bas point de fusion) pour maintenir leur structure avant le tranchage.
3. Les tranches (200-500 µm) sont préparées à l’aide d’un trancheur Krumdieck, d’un vibratome ou d’un autre outil adapté.

Méthodes de culture :

• Les tranches sont cultivées soit :
• En rouleaux (roller tubes).
• Dans des plaques à puits (généralement en milieu liquide ou semi-liquide).
• Durée de culture : Quelques jours à un mois selon les conditions expérimentales.

Observations possibles :

• Les voies respiratoires et les artérioles adjacentes restent visibles, permettant des études comparatives entre ces structures.
• L’acétylcholine contracte uniquement les SMC des voies respiratoires.
• La sérotonine (5HT) contracte à la fois les SMC des voies respiratoires et des artérioles.

Applications :

1. Asthme : Modélisation des contractions des bronchioles et réponses aux stimuli comme la méthacholine.
2. Physiologie pulmonaire : Étude de l’activité ciliaire : mouvement des cils pour éliminer les pathogènes et fluides ou analyse de la circulation des fluides dans l’épithélium pulmonaire.
3. Réponse à des polluants : Exposition des tranches aux fumées, nanoparticules ou autres contaminants pour comprendre leur impact.
4. Interactions hôte-pathogène : Co-cultures avec macrophages alvéolaires pour étudier les réponses inflammatoires.

Avantages :

• Conservation de la structure pulmonaire et des interactions cellulaires complexes.
• Modèle réaliste pour simuler des pathologies pulmonaires.

Limites :

• Disponibilité limitée des tissus humains.
• La culture prolongée reste un défi pour maintenir la viabilité des tissus.

Origine et préparation :

1. Cellules utilisées :

• Cellules souches embryonnaires (CSE) ou cellules souches pluripotentes induites (iPSC).

1. Milieu de culture :

• Utilisation de matrices extracellulaires comme le Matrigel, enrichies en facteurs spécifiques (ex : laminine).

1. Principe :

• Les cellules ne collent pas au support mais s'agrègent pour former des structures tridimensionnelles, proches de l’in vivo.

Développement des structures 3D :

1. Étapes clés :

• Formation de corps embryonnaires à partir de cellules souches.
• Induction de la différenciation vers des tissus spécifiques en ajoutant des facteurs de croissance (ex : Nodal, activine).

1. Exemple d’application :

• Rétinogenèse : Les cellules souches embryonnaires de souris sont différenciées en tissus rétiniens.

Applications des structures 3D :

1. Développement d’organoïdes :

• Les cellules souches auto-organisées peuvent former des organoïdes (mini-organes en culture).

• Cryptes intestinales :
• Préparation : Les cryptes de l’intestin grêle de souris sont isolées.
• Culture : Mélangées avec du Matrigel, avec ajout d’EGF, R-spondine 1 (agoniste Wnt), et Noggin.
• Résultat : Formation de structures de type cryptes intestinales capables de générer de nouveaux organoïdes.

1. Recherche en biologie cellulaire et médicale :

• Étude des mécanismes de différenciation cellulaire.
• Modélisation de maladies (ex : cancer colorectal, troubles de développement).

Origine et préparation :

1. Principe :

• Reprogrammation de cellules adultes différenciées (comme les fibroblastes) en cellules souches pluripotentes grâce à l’introduction de facteurs de transcription spécifiques.
• Facteurs classiques : OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC.

1. Processus :

• Introduction de ces facteurs via un vecteur viral.
• Les cellules reprogrammées acquièrent un état de pluripotence, semblable aux cellules souches embryonnaires.
• Formation de corps embryonnaires (EB) en culture flottante, suivie de leur différenciation en types cellulaires spécifiques.

Génération d'organoïdes cérébraux à partir de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC):

Les cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) sont utilisées pour créer des organoïdes cérébraux, des structures 3D mimant le développement et l'organisation du cerveau humain.

Étapes :

1. Formation de corps embryonnaires (EB) : Les hPSC sont dissociées en cellules uniques, puis laissées à s'agréger pour former des EB en culture flottante.
2. Induction neuronale : Les EB sont exposés à des signaux spécifiques pour favoriser la formation de tissus neuroectodermiques.
3. Culture dans du Matrigel : Les tissus neuroectodermiques sont transférés dans une goutte de Matrigel qui sert de support pour la croissance.
4. Culture en bioréacteur rotatif : Les tissus sont placés dans un bioréacteur rotatif ou une plaque vibrante, permettant un meilleur échange d’oxygène et de nutriments pour leur développement.
5. Maturation : Après 20 à 30 jours, des régions rappelant des structures cérébrales définies (comme le cortex) émergent.

Limites des organoïdes cérébraux :

1. Manque de vascularisation : Absence de système circulatoire, limitant les échanges d'oxygène et de nutriments. Cela entraîne une mort cellulaire étendue dans les régions internes des organoïdes.
2. Taille limitée : Les organoïdes ne peuvent croître que jusqu'à quelques millimètres, réduisant leur complexité.
3. Organisation incomplète : Les régions cérébrales formées sont imparfaitement organisées par rapport à un cerveau humain in vivo.
4. Variabilité entre les organoïdes : Les protocoles actuels produisent des organoïdes avec des différences significatives en taille et structure, ce qui complique les analyses

1. Origine et différenciation :

• Les cellules souches embryonnaires (ESC) ou pluripotentes induites (iPSC) sont utilisées.
• Étant d'origine mésodermique, ces cellules doivent être exposées à des signaux spécifiques pour se différencier en tissu rénal.

Étapes clés de la différenciation :

1. Signalisation Wnt : Utilisation de CHIR99021, un inhibiteur de GSK-3, pour activer la voie Wnt et amorcer la différenciation mésodermique.
2. Ajout de FGF9 : Favorise le développement des structures rénales.

2. Structures obtenues dans les organoïdes rénaux :

1. Néphrons fonctionnels : Les organoïdes contiennent des néphrons, l'unité fonctionnelle du rein, essentiels pour la filtration du sang.
2. Canaux collecteurs : Un réseau de canaux collecteurs connectés aux néphrons.
3. Autres composants cellulaires : Cellules interstitielles et cellules endothéliales, nécessaires au soutien structurel et aux échanges vasculaires.

3. Perfectionnement du protocole :

• Les protocoles récents permettent de créer des organoïdes rénaux d’ordre supérieur avec une organisation plus proche de l’anatomie d’un rein humain.
• Caractéristiques améliorées :
• Néphrons connectés à un arbre unique de bourgeon urétéral.
• Formation de petits bourgeons urétéraux fonctionnels.

Microcéphalie : Maladie caractérisée par une réduction du volume cérébral. Utilisation d’organoïdes dérivés de cellules de patients atteints de microcéphalie.

Après 30 jours de culture, les organoïdes montrent :

• Réduction de SOX2, un marqueur des progéniteurs neuronaux.
• Différenciation neuronale précoce, ce qui limite la prolifération des cellules.

Lissencéphalie (Syndrome de Miller-Dieker) : Trouble causé par des mutations génétiques (délétion 17p13.3), entraînant un défaut d’organisation du cortex cérébral.

• Les organoïdes issus des patients sont plus petits que les organoïdes contrôles.
• Perturbation de la croissance neuronale et organisation désorganisée.

Le cancer colorectal est l'un des cancers les plus courants, souvent associé à des mutations génétiques dans des gènes comme APC, KRAS, P53, et SMAD4.

Modèle :

• Organoïdes intestinaux dérivés de cellules souches intestinales humaines (hiPSC).
• Utilisation de l'édition du génome avec CRISPR/Cas9 pour introduire des mutations spécifiques liées au cancer colorectal.
• Étude de la progression tumorale dans des organoïdes génétiquement modifiés, montrant des caractéristiques similaires à celles du CCR humain.

Modèles de cancer courants :

• Lignées de cellules cancéreuses
• Limites des xénogreffes :

Organoïdes tumoraux dérivés de patients

Les organoïdes tumoraux issus directement de tissus tumoraux de patients représentent une alternative prometteuse aux modèles traditionnels :

Avantages :

• Modèle expérimental plus fidèle pour étudier le cancer.
• Permet de tester des médicaments et de réaliser de la médecine personnalisée.
• Les transplantations d'organoïdes tumoraux permettent de valider les médicaments sélectionnés in vitro dans un environnement in vivo.

Protocoles de culture des organoïdes tumoraux :

• Les protocoles utilisés pour cultiver des organoïdes à partir de cellules souches humaines saines ont été adaptés pour générer des organoïdes tumoraux à partir de tumeurs dérivées de patients.
• Différents sous-types de tumeurs nécessitent des compositions spécifiques de milieux de culture.
• Les organoïdes tumoraux croissent souvent plus lentement que les organoïdes sains.

Applications des organoïdes tumoraux :

1. Modélisation du cancer : Utilisation d’organoïdes pour étudier les mutations dans des cancers courants (ex : colorectal, pancréatique, gastrique).

• Mutations étudiées :
• KrasG12D, perte de p53 dans les organoïdes pancréatiques et gastriques.
• Combinations de mutations comme APC, p53, KrasG12D et Smad4 pour simuler le cancer colorectal.

1. Tumorigénicité :

• Les organoïdes du côlon montrent une tumorigénicité lorsqu'ils portent les mutations appropriées.
• L’organoïde pancréatique et gastrique devient tumorigène après l’introduction de mutations dans KrasG12D et p53.

1. Criblage de médicaments :

• Des biobanques d’organoïdes tumoraux et de tissus sains sont utilisées pour effectuer un criblage de médicaments à haut débit.
• Cette approche permet d'identifier des associations gène-médicament, facilitant ainsi la création de thérapies personnalisées.

Établissement et caractéristiques des organoïdes tumoraux :

• Exemple d'application :
• Des organoïdes tumoraux ont été établis à partir de 20 patients consécutifs atteints de carcinome colorectal.
• Les organoïdes tumoraux présentent des morphologies spécifiques au patient.
• Le nombre d'organoïdes tumoraux primaires varie en fonction des échantillons de patients.
• Les taux de mutation dans les régions codantes des organoïdes sont très concordants avec les biopsies des patients (hypermutés et non hypermutés).

Enquête sur la sensibilité aux médicaments dans le cancer colorectal

• Test de médicaments sur des organoïdes tumoraux issus de patients.
• Exemple :
• L'inhibition de la voie Wnt par l'inhibiteur IWP2 a montré une réduction significative de la croissance des organoïdes P19b mutants, suggérant une cible thérapeutique potentielle pour le cancer colorectal.

1. Injection de cellules tumorales sous forme de gouttelettes :

• Méthode :
• Les cellules tumorales sont injectées sous forme de suspensions unicellulaires et encapsulées dans des gouttelettes aqueuses de taille nanolitre.
• Les gouttelettes circulent dans un canal de distribution jusqu’à un compartiment principal de la puce, où elles sont immobilisées sur des pièges.
• En 24 heures, les cellules sédimentent au fond des gouttelettes et forment un sphéroïde unique par gouttelette.
• Avantage :
• Chaque sphéroïde est traité individuellement, permettant de tester plusieurs conditions simultanément grâce à l'ajout séquentiel de gouttelettes de contenu différent.
• Chaque gouttelette contient un code-barres avec des fluorophores pour identifier les sphéroïdes et suivre leurs réponses aux traitements.

2. Dispositifs de culture micro-ingénierie :

• Méthodes :
• Utilisation de réseaux de microcavités dans un substrat polymère-hydrogel pour la culture en suspension d'organoïdes gastro-intestinaux.
• Les systèmes automatisés permettent l'analyse en temps réel de milliers d'organoïdes individuels.
• Phénotypage automatisé :
• Marquage des organoïdes avec de la calcéine-AM (cellules vivantes, fluorescence verte) et de l'éthidium homodimère-1 (cellules mortes, fluorescence rouge).
• Analyse d'image pour segmenter les sphéroïdes et organoïdes et observer leur croissance et réponse au traitement.

3. Organoïdes cérébraux : vers des organoïdes cérébraux vascularisés ?

• Co-intégration de progéniteurs vasculaires :
• La co-intégration de progéniteurs vasculaires et de corps embryonnaires (EB) neuroépithéliaux permet la création de fusions d'organoïdes vasculaires et cérébraux.
• Le but est d’ajouter de la neurovascularisation dans les organoïdes cérébraux pour simuler un environnement plus réaliste.
• Résultats :
• La neurogenèse est augmentée, et la formation de vaisseaux sanguins à côté des neurones favorise leur développement fonctionnel.

4. Organoïdes intestinaux : améliorer le modèle

• Combinaison de hiPSC et organoïdes intestinaux :
• En combinant des cellules de la crête neurale dérivées de hiPSC avec des organoïdes intestinaux, on crée un système nerveux entérique fonctionnel (SNE).
• Les cellules ENS (système nerveux entérique) migrent dans le mésenchyme, se différencient en neurones et cellules gliales, et génèrent une activité neuronale coordonnée.
• Mesure de l’activité :
• Imagerie en direct du flux de Ca2+ dans les cellules ENS exprimant GCaMP6f, un indicateur fluorescent de l’activité neuronale.
• Les organoïdes intestinaux avec SNE montrent une activité contractile médiée par le système nerveux entérique.
• Réponse à la stimulation électrique :
• hIO sans ENS réagit par une contraction unique sous une impulsion de 1 ms à 100 V, indiquant une stimulation directe du muscle lisse.
• hIO avec ENS nécessite seulement 50 V pour provoquer des contractions soutenues, montrant l’importance du SNE pour la réponse musculaire.

5. Organoïdes cérébraux : vers l’assemblage de multiples organoïdes

• Combinaison de différents organoïdes :
• Assemblage d'organoïdes cérébraux avec des organoïdes spinaux, musculaires et corticaux pour créer des modèles plus complexes.
• Ces modèles peuvent simuler des circuits neuronaux plus réalistes, notamment pour étudier les connexions entre différents types de tissus.
• Culture dans du Matrigel :
• Les organoïdes sont cultivés dans du Matrigel pour permettre leur développement et leur maturation en un environnement tridimensionnel.
• Utilisation du glutamate pour l'activation :
• Des cellules modifiées génétiquement pour exprimer un glutamate non fonctionnel sont utilisées pour tester la réponse neuronale. Une fois rendues fluorescentes, elles permettent d'étudier l’activation du glutamate dans les circuits neuronaux.