Étapes d'un cycle de PCR :
- Dénaturation (92-95°C) : Séparation des deux brins d'ADN double brin en brins simples par chauffage.
- Hybridation (50-65°C) : Les amorces, de courts fragments d'ADN spécifiques, s'hybrident aux extrémités de la séquence d'intérêt sur chaque brin d'ADN simple.
- Elongation (72°C) : La Taq polymérase synthétise un nouveau brin d'ADN en ajoutant des nucléotides à partir des amorces.
Réactifs essentiels :
- Taq polymérase : ADN polymérase thermorésistante qui résiste aux températures élevées de dénaturation.
- dNTPs (désoxyribonucléotides triphosphates) : Bases nécessaires pour la synthèse du nouvel ADN.
- Amorces (primers) : Courtes séquences d'ADN spécifiques de 18 à 30 nucléotides qui déterminent la région à amplifier.
- Tampon de réaction (contenant Mg²⁺) : Assure un environnement chimique optimal pour l'activité enzymatique.
- Fragment d'ADN cible : Matrice à amplifier.
Types de PCR :
- PCR classique : Permet l'amplification d'un fragment d'ADN avec un nombre défini de cycles et la visualisation du produit final.
- RT-PCR (Reverse Transcription PCR) : Permet la conversion de l'ARN en ADNc avant l'amplification.
- PCR quantitative (qPCR) : Permet la quantification en temps réel de l'ADN amplifié grâce à des marqueurs fluorescents.
- PCR multiplexe : Amplifie plusieurs séquences cibles en une seule réaction.
- PCR nichée (Nested PCR) : Utilise deux séries d'amorces successives pour augmenter la spécificité.
- PCR digitale : Compartimente la réaction dans des microréacteurs pour une quantification précise.
Conception des amorces :
- Longueur : 16-26 nucléotides.
- contenu en GC : 40-60% pour assurer une bonne stabilité.
- Température de fusion (Tm) : Comparables entre les amorces utilisées dans la même réaction.
- Spécificité : Les amorces doivent être spécifiques à la séquence cible, sans complémentarité interne ou entre elles pour éviter la formation de dimères.
Conditions de réaction :
- Température de dénaturation : Fixe (92-95°C).
- Température d'hybridation (Ta) : Dépend des séquences des amorces et est légèrement inférieure à la Tm.
- Température d'élongation : Fixe à ~72°C pour l'ADN polymérase.
Produits finaux : Après n cycles de PCR, on obtient environ 2ⁿ copies du fragment cible.
Types de gels :
- Gel d'agarose : Utilisé pour séparer les fragments d'ADN/ARN de grande taille (~1 à 60 kb).
- Gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) : Utilisé pour les petites molécules ou protéines.
Migration : Les acides nucléiques sont chargés négativement et migrent vers l'anode (+). La vitesse de migration est inversement proportionnelle à la taille des fragments. Les gels d'agarose permettent une séparation en fonction de la taille, les petites molécules migrant plus rapidement.
Visualisation : Les fragments d'ADN sont rendus visibles grâce à des colorants comme le bromure d'éthidium (BET) ou des alternatives moins toxiques (ex. Gel Red).
Applications : Vérification de la taille des fragments amplifiés par PCR. Identification de fragments après digestion enzymatique. Séparation pour purification.
Techniques de détection :
- SYBR Green : Fluorescence liée à l'ADN double brin.
- Sondes fluorescentes : Comme les Molecular Beacons, émettant de la fluorescence lorsqu'elles s'hybrident à l'ADN cible.
Paramètre clé : Ct (Cycle threshold) : Nombre de cycles nécessaires pour que la fluorescence dépasse le seuil de détection, inversement proportionnel à la quantité d'ADN initiale.
Applications :
- Quantification microbienne.
- Expression génique.
- Oncologie.
PCR multiplexe : Amplifie plusieurs fragments spécifiques simultanément grâce à différents couples d'amorces.
PCR nichée : Augmente la spécificité grâce à deux paires d'amorces et deux réactions successives.
Applications : Détection et quantification précise du SARS-CoV-2.
