Il existe deux applications à l’Enzymologie :

▪ La biologie médicale : on va mesurer les enzymes dans le sang des patients, pour cela on utilisera la vitesse des réactions qui vont être catalysées par ces enzymes. Exemple : Avant, on testait la présence de glucose grâce à la liqueur de Fehling qui réagissait avec les fonctions aldéhydiques. Aujourd’hui, on se sert de techniques plus spécifiques comme le dosage des enzymes spécifiques du glucose.

▪ Les médicaments, car certains médicaments peuvent inhiberles enzymes (Càd les bloquer/neutraliser), et on utilisera à nouveau la vitesse de réaction pour déterminer la présence ou non d’enzymes.

Par exemple : L’Aspirine (inhibe la synthèse des prostaglandines par son action sur les cyclo-oxygénases).

I. POUVOIR CATALYTIQUE ET CINETIQUE DES ENZYMES

I.A. GENERALITES

1. Nature et rôle

Les enzymes sont le plus souvent des protéines et parfois des ARNr (ribozymes). Quand ce sont des protéines, elles ont en général des hélices alpha et des feuillets béta antiparallèles. Elles ont un rôle de catalyseur biologique (≠ catalyseur chimique)

Elles accélèrent les réactions chimiques dans le système biologiques d'un facteur 10^6 au minimum

La capacité d'accélération des enzymes est très variable :

o OMP décarboxylase (synthèse des bases pyrimidiques) : 10^17 ▪ Cette enzyme possède la plus grande vitesse de catalyse. ▪ Accélère la réaction de 78 millions d'année (temps que mettrait la réaction sans enzyme) à 18 ms.

o- Les catalyseurs sont en quantité très faible par rapport aux substrats dont elles vont accélérer la réaction.

- Cette spécificité est toutefois relative, avec une reconnaissance plus ou moins spécifique du substrat

=> Les enzymes sont hautement spécifiques de la réaction catalysée & du substrat transformé

Exemples : Enzymes protéolytiques (= protéases = enzymes qui brisent les liaisons peptidiques des protéines) :

o Subtilisine (origine bactérienne): liaison X-X (avec X = n’importe quel AA). La subtilisine est donc très peu spécifique car elle clive n’importe quelle liaison peptidique.

o Trypsine (enzyme pancréatique qui permet de digérer les protéines d’origine alimentaire) : Arg-X et Lys-X (clive que du côté COOH/ Pas de clivage si la proline est adjacente). o Thrombine (pour le processus de coagulation) : clive toujours entre Arg-Gly → enzyme dite spécifique.

IMPORTANT +++

=>Elles accélèrent les réactions chimiques dans les systèmes biologiques d'un facteur 106 au minimum.

=> Les enzymes sont hautement spécifiques de la réaction catalysée & du substrat transformé

2. Constitution d'un complexe enzymatique

Souvent, les enzymes sont des complexes entre des protéines et des molécules non protéiques.

On appelle holoenzyme l'ensemble apoenzyme + cofacteur :

• L'apoenzyme est la partie protéique thermolabile (Càd qu’avec la chaleur les liaisons faibles entre les acides aminés sont cassées, on perd la structure tridimensionnelle de la protéine →perte de l’activité biologique due à cette structure 3D). L’apoenzyme peut être une chaîne unique ou un oligomère.

• Le cofacteur est la partie non protéique thermostable. Il s’agit soit de :

o Molécules non organiques

Ions métalliques : Zn2+ est le cofacteur de l’anhydrase carbonique.

Mg2+ est le cofacteur de l’ADN polymérase.

o Molécules organiques non protéiques :

▪ Groupements prosthétiques ou coenzymes vrais: Petites molécules organiques fortement liées au site actif de l'enzyme (liaisons covalentes).

▪ Coenzymes mobiles ou co-substrat: Petites molécules organiques capables de se fixer réversiblement au site actif de l'enzyme (liaisons faibles). Ils peuvent donc s'associer à plusieurs apoenzymes différentes.

▪ Les cofacteurs organiques sont souvent des vitamines hydrosolubles.

3. Notion de site actif

L'interaction entre l’enzyme (E) et substrat (S) ne concerne que quelques acides aminés de l’enzyme : c'est le site actif de l'enzyme. Le site actif a deux types de complémentarités :

➢ Complémentarité spatiale/géométrique (forme 3D) : le site actif représente une cavité complémentaire du substrat pour le réceptionner, comme les pièces d’un puzzle.

➢ Complémentarité physique : Formation de liaisons faibles (de type hydrophobes, hydrogènes, ionique ou électrostatiques...) entre le site actif et le substrat, assurant ainsi la spécificité de l'interaction enzyme/substrat (=interaction ES).

Le site actif comprend deux groupes d'acides aminés :

- Un groupe de reconnaissance spatiale et d'établissement de liaisons

- Un groupe de transformation chimique du substrat en produit : site catalytique

Site actif = AA de l’enzyme qui interagissent avec le substrat

Ce sont souvent de grosses protéines qui parfois vont avoir de tous petits substrats à transformer (1 ou 2 AA par ex.).

Exemple : Site actif du lysozyme : C’est la première ligne de défense contre les bactéries dans le mucus nasal : le lysozyme rompt/clive la chaîne polyosidique qui constitue la membrane des bactéries.

4. Modèles d’interaction

→ Modèle clé-serrure de Fischer (1890) :

o Structure rigide du site actif de l’enzyme qui s’adapte rigoureusement au substrat qui vient se fixer à l'intérieur.

Ce modèle a évolué et n’est plus d’actualité. Il ne prend pas en compte le fait que les structures tertiaires de l’enzyme et du substrat évoluent.

→ Modèle actuel de Koshland (1957) :

o Modification conformationnelle de l’enzyme (E) lors de l'association au substrat (S), permettant une orientation optimale des groupes catalytiques :

on parle d’adaptation induite/ajustement induit dynamique. Ainsi, des molécules (différentes du substrat) peuvent entrer dans le site catalytique, mais ne donnent pas à l'enzyme la bonne conformation (elles ne font pas les bonnes liaisons) → le site catalytique n'a alors pas la bonne forme pour transformer le substrat en produit.

5. Nomenclature EC (Commission Enzyme)

C’est une nomenclature internationale qui permet de classer numériquement les enzymes. Chaque enzyme a un code à 4 chiffres (par ex. EC 3.4.11.4 qui caractérise le tripeptide aminopeptidase) et chaque chiffre indique une caractéristique de l’enzyme :

o Le 1er chiffre indique à laquelle des grandes réactions chimiques appartient l’enzyme (pas besoins d’apprendre quel numéro fait quoi, juste retenez le principe de nomenclateur): -

o Le 2ème chiffre indique le substrat général impliqué lors de la réaction

o Le 3ème chiffre indique le substrat spécifique impliqué

o Le 4 ème chiffre est le numéro de série de l’enzyme

I.B. CATALYSE ENZYMATIQUE

Pour qu’une réaction puisse se faire, le substrat doit avoir une énergie supérieure au produit.

1. Aspect thermodynamique

- Énergie libre : Un substrat (ou toute biomolécule) a une énergie libre (notée G) qui lui est propre. La réaction est thermodynamiquement possible si la variation d’énergie ∆G = Gproduit - Gsubstrat < 0. C’est-à-dire si la réaction est exothermique (libère de la chaleur).

- Énergie libre d’activation (Gs- Gétat de transition) : La différence d'énergie libre du substrat entre son état d'activation et son état initial. → En l'absence de catalyseur, les réactions sont lentes car l'état de transition du substrat se trouve à un niveau d'énergie libre élevé, et donc l'énergie libre d'activation est importante. En présence de l'enzyme, l'énergie libre d'activation est considérablement réduite et rend probable la réaction.

→ Donc plus l’énergie libre d’activation augmente, plus la vitesse de réaction diminue. (mnémo : image d’un col de montagne à franchir: Plus il est haut, plus c’est difficile et plus on met longtemps)

 Les enzymes accélèrent les réactions en diminuant l'énergie libre d'activation, ce qui explique que la réaction soit accélérée d'un point de vue thermodynamique. Pour cela, elles mettent les substrats dans une conformation qui va faciliter l'atteinte de l'état de transition. Ceci se fait grâce aux liaisons faibles qui apportent de l'énergie de liaison et font diminuer l'énergie libre d'activation.

→ Les enzymes NE PEUVENT PAS rendre possible une réaction ENDERGONIQUE (∆G > 0). Elles ne catalysent que des réactions EXERGONIQUE (∆G < 0). Celles qui vont vers une moins grande énergie libre.

→ De plus, les enzymes ne déplacent pas l’équilibre de la réaction qui ne dépend que de ΔG (les concentrations en substrats et en produits à l’équilibre restent identiques), l’équilibre est juste atteint plus vite.

→ L’état de transition est la forme la moins stable du substrat.

Une enzyme n’est jamais modifiée après une réaction. Elle revient toujours à son état initial pour pouvoir recommencer la réaction.

Réaction endergonique (∆G > 0) : Réaction qui nécessite un apport d’énergie extérieur pour se réaliser.

Réaction exergonique (∆G < 0) : Réaction qui libère de l’énergie

2. Mécanismes moléculaires de la catalyse enzymatique

Exemple 1 : Chymotrypsine :

La chymotrypsine (EC 3.4.21.1 → 21 pour sérine) n’utilise pas de cofacteur. Elle clive après Phe et Trp qui sont des AA aromatiques, par contre, si le X est une proline, elle a du mal à cliver.

La chymotrypsine est une enzyme protéolytique pancréatique de la famille des sérine-protéases (elle permet de digérer les protéines d’origine alimentaire). Elle clive les liaisons Phe-X et Trp-X.

Le site actif contient une triade catalytique (Ser–His–Asp) comportant une sérine activée par déprotonation.

Pendant la première étape, l’aspartate permet de correctement positionner l’histidine ,pour qu’elle puisse arracher le proton.

La chymotrypsine a un peu le même mode d’action que la trypsine.

Etape 1 :

o L’histidine arrache un proton (déprotonisation) à la sérine ce qui génère un ion alkoxyde (O- ) o Cet ion a un pouvoir nucléophile et attaque l’atome de carbone au niveau de la fonction carbonyle (C=O) du substrat.

Etape 2 :

o Clivage de la liaison Phe–X après intervention de l’histidine : car l'intermédiaire obtenu est instable.

o C’est la réaction limitante du processus de lyse.

o L’histidine donne alors son proton à la chaine polypeptidique générée.

Etape 3 :

o Obtention d’un intermédiaire acyl-enzyme et libération du premier produit

Etape 4 :

o Attaque d’un H2O sur la liaison Ser–Phe qui la rompt

 La protéolyse est une réaction d’hydrolyse : une molécule d'eau a la même fonction que la Sérine.

1. L'histidine arrache un proton à H2O (tandis qu’à l’étape 1 l’histidine arrachait un proton à la sérine).

2. Formation d'un groupe OH- qui attaque le carbone du groupement carbonyle de la liaison peptidique.

3. Formation d’un intermédiaire instable

4. Réorganisation électronique qui permet de libérer l'enzyme de son substrat

Etape 5 :

o Libération du produit

o L’enzyme revient à son état initial.

Exemple 2 : Anhydrase carbonique (EC 4.2.1.1) (facteur d’accélération 10^6 ) :

L’anhydrase carbonique est une enzyme intervenant dans la régulation acido-basique de l’organisme (balance CO2 HCO3 - ) et permet de maintenir le pH à 7,4, elle a un rôle de solution tampon afin de maintenir un pH constant.

Pour cela, elle transforme le CO2 en HCO3 - = ions bicarbonates. Elle contient un ion zinc (Zn2+ est le cofacteur de l’anhydrase carbonique) responsable de l'activation d'une molécule d'eau permettant d’hydrater le CO2 pour former un ion carbonate HCO3 - .

ATTENTION : Le CO2 a un caractère acide car il peut se transformer en acide carbonique. C’est pour cela qu’un moyen de compenser une acidose métabolique est d’hyperventiler car comme cela on expulse plus de CO2 et il risque moins de produire de l’acide carbonique.

1. L’ion zinc est lié au substrat qui, au départ, est une molécule d'eau. (Zn2+ est électroattracteur).

2. L'ion zinc participe à l'élimination d'un proton de la molécule d'eau et permet la formation d'un ion hydroxyde (OH- ) → similitude avec la chymotrypsine.

3. L'ion hydroxyde attaque une molécule de CO2 par une attaque nucléophile sur le carbone de la fonction carbonyle.

4. Hydratation du CO2 → formation de l'ion bicarbonate HCO3 - .

5. L'ion bicarbonate est remplacé par une molécule d'eau, l'enzyme revient à son état de départ, et elle peut à nouveau hydrater une molécule de CO2.

I.C. CINETIQUE ENZYMATIQUE

1. Définitions

Cinétique enzymatique :

- La cinétique réactionnelle est définie par la vitesse réactionnelle v (vitesse enzymatique) - Il s'agit de la vitesse de variation de concentration en produit/en substrat. On peut prendre soit l'un soit l'autre car la variation en produit est égale à l’opposé de la variation en substrat.

Vitesse initiale (v0):

- On définit également, à un temps très proche de 0, la vitesse initiale v 0 : v0 = ( d[P] dt ) t=0 .

- La vitesse initiale correspond à la vitesse au tout début de la réaction (t ≈ t0) et loin de l’équilibre.

- Elle est constante tant que les conditions initiales sont maintenues (c’est-à-dire tant que Δ[S] et Δ[P] sont négligeables.

En pratique : consommation de moins d'1 % du substrat).

On observe que la vitesse de réaction varie pendant toute la durée de la réaction.

➢ Entre t0 et t1 :

o La vitesse correspond à la vitesse initiale v0 et elle est constante.

o La variation de [P] en fonction du temps est linéaire pendant cette période, et s'apparente à une droite affine.

o La vitesse initiale v0 est la pente de la tangente à la courbe en t0 qui est superposable à la courbe tant que les conditions initiales sont respectées.

➢ Après t1:

o Les conditions initiales ne sont plus respectées (Δ[S] et Δ[P] ne sont plus négligeables.)

o La vitesse diminue progressivement

2. Les 2 étapes de la réaction enzymatique :

• 1. Formation d'un complexe ES (enzyme-substrat)

La formation du complexe ES est une réaction bidirectionnelle/ réversible, chacune des étapes a une constante :

o k1 est la constante caractéristique de la formation du complexe

o k-1 est la constante caractéristique de la réaction dans le sens indirect (quand E et S se dissocient).

Formation d'un complexe ES avec une plus ou moins grande affinité de l'enzyme pour son substrat et une plus ou moins grande facilité à former ce complexe.

Il existe une constante qui donne l'affinité de l'enzyme pour son substrat : 𝐾𝑎𝑓𝑓 = 𝑘1 𝑘−1 = 1 𝐾𝑑 Plus k1 > k-1, plus Kaff est grande et plus Kd (constante de dissociation) est petite, donc la vitesse de formation du complexe est grande par rapport à la vitesse à laquelle il se défait.

• 2. Catalyse : Transformation du substrat en produit :

Succession de réactions intermédiaires permettant la transformation du substrat en produit. Dans les conditions initiales, la réaction « retour» (et donc la constante k-2) est négligeable, car on a très peu de produit formé.

K2 est appelée kcat (ou constante catalytique).

L’enzyme retrouve toujours son état initial à la fin de la réaction et peut donc catalyser une nouvelle réaction

→ avec une seule enzyme on peut transformer plusieurs molécules de substrats.

L’étape de catalyse peut même être dix mille, cent mille voire un million de fois plus longue que l’étape de complexation (pas que 1000 fois).

L'étape de catalyse étant très lente devant la formation du complexe ES (environ 1000 fois plus lente), on négligera k1 et on admet une nouvelle expression de la vitesse initiale : v0 = ( d[P] dt ) t=0 = kcat[ES]. 

Ceci correspond à considérer que la vitesse de l'ensemble correspond à la vitesse de la seconde étape. [ES] est très difficile à mesurer car c'est une fraction particulière de l'enzyme, on va donc chercher à trouver [ES] avec des concentrations que l'on connaît mieux.

3. Expression mathématique de la vitesse initiale : équation de Michaelis-Menten

Evolution des concentrations au cours de la réaction :

o L'état pré-stationnaire : correspond à la formation du complexe ES (imperceptible en réalité).

o L'état stationnaire : Le complexe ES va très vite arriver à son équilibre et donc atteindre une concentration constante. Il correspond aux conditions initiales, c'est pendant cette période que l'on calcule la vitesse initiale.

4. Equation de Michaelis-Menten :

Vmax : Lorsque toutes les enzymes sont complexées par du substrat (substrat saturant), alors la vitesse initiale pour une réaction donnée est maximale : v0 = vmax. Donc : [𝐸]0 = [𝐸𝑆] puisque toutes les enzymes à l’état initial sont complexées par du substrat et 𝑣0 = 𝑣𝑚𝑎𝑥 → on remplace donc 𝑣0 et [𝐸𝑆] dans l’expression 𝑣0 = 𝑘𝑐𝑎𝑡[𝐸𝑆]

5. Constante de Michaelis Km

- La valeur Km est une caractéristique d’un couple enzyme-substrat et dépend des conditions expérimentales (pH, température…).

- Km n'est pas spécifique d'une enzyme, si une enzyme a plusieurs substrats elle a plusieurs Km.

- La constante de michaelis 𝐾𝑚 est exprimée comme une concentration, en mol/L.

- Les valeurs de Km sont souvent comprises entre 10-1 et 10-7 M (M = mol/L).

- Plus le 𝑲𝒎 est petit, plus l’affinité est grande (le prof peut vous donner plusieurs valeurs de 𝐾𝑚 et vous demander de comparer l’affinité).

- Le 𝑲𝒎 a une valeur en dessous d’1 mol/L. Donc si lors de calculs vous obtenez un 𝑲𝒎 supérieur à ça, vous vous êtes trompez dans vos calculs.

Km est inversement proportionnel à l’affinité d’une enzyme pour un substrat donné.

En termes de concentrations en substrat, Km est la concentration en substrat pour laquelle 50 % des enzymes sont complexées :

6.Constante catalytique Kcat

La constante catalytique 𝑘𝑐𝑎𝑡 traduit le nombre de moles de substrat transformées par mole d'enzyme et par unité de temps quand l'enzyme est saturée en substrat. Elle s'exprime en s -1 .

𝐾𝑐𝑎𝑡 est enfaite la fréquence à laquelle l’enzyme transforme le substrat (quand elle est saturée par le substrat).

7. Influence des paramètres réactionnels sur la vitesse initiale

• Influence de la concentration en enzyme

- D’après l’équation de Michaelis-Menten, la vitesse initiale est proportionnelle à la concentration initiale en enzyme.

• Influence de la température

- Les enzymes possèdent un pic d'activité à une température donnée (température optimale).

L’enzyme et le substrat s’associent plus facilement. Mais si trop de chaleur est apportée, l’enzyme est dénaturée

L’apoenzyme (partie protéique thermolabile) perd sa structure III ou IV et donc son activité.

- La plupart des enzymes du milieu physiologique humain possèdent un pic à 37.5°C, mais certaines enzymes utilisées en PCR par exemple peuvent avoir un pic à 100°C.

→ Vous vous doutez donc que si on a 41°C ca peut être vraiment dangereux …On risque en effet la dénaturation des protéines

• Influence du pH (potentiel hydrogène)

- De même, les enzymes possèdent un pH optimal, pour lequel toutes les chaînes latérales des AA sont ionisées de manière à reconnaître le substrat, à avoir la bonne conformation tridimensionnelle.

- Si l'on s'écarte de ce pH optimal, les groupements perdent leur charge, modifiant les liaisons faibles → cela diminue l’affinité pour le substrat.

- Pour la plupart des enzymes, le pH optimal est situé autour de 6-8 (neutre), mais certaines présentent un pic en milieu très :

o Acide : Pepsine : 1.5-2 (acide)

o Basique : Arginase : 9.5-10 (basique)

- Les mécanismes de déprotonations sont également influencé par le pH.

8. . Les inhibiteurs enzymatiques :

8.1. Les inhibiteurs Irréversible

Comme leurs noms l’indique ces inhibiteurs se fixent une bonne fois pour toute sur l’enzyme de manière covalente (inhibiteur suicide).

8.2. Les inhibiteurs réversibles

Contrairement aux irréversibles, les réversibles forme un complexe par des liaisons non covalentes (liaisons faibles) et donc dissociable.

8.3. L’inhibiteur compétitif :

C’est un analogue structural du substrat (structure 3D proche) Il rentre en compétition avec le substrat pour se fixer sur le site actif.

Exemple : Avec les statines (qui est un traitement des hypercholestérolémie) permet de diminuer la synthèse de cholestérol.

Enzyme clé : HMG CoA réductase

La lovastatine rentre en compétition avec l’HMG coA substrat. L’enzyme peut donner 2 types de complexes réversibles : ES et EI

Ki a entre guillemets les mêmes propriétés que Km. Cela permet de donner un ordre d’idée de l’affinité pour l’inhibiteur

(I) = concentration en inhibiteur

Km est artificiellement augmenté

Exemple avec la représentation de Michaelis-Menten (MM) inhibition compétitive : On se met volontairement en concentration de substrat saturante/ limitante => Qui sera environ égale Vmax.

Plus on augmente la concentration en inhibiteur, plus le Km augmente.

Pour rappel: c’est logique le Km qui bouge car ici c’est un inhibiteur compétitif qui va empêcher la mise en place de ES diminuant ainsi l’affinité et augmentant Km

Dans l’inhibition compétitive, Vmax n’est pas modifié, mais seulement Km

8.4. L’inhibiteur non compétitif

Cet inhibiteur se fixe sur l’enzyme sur un site différent du site actif. PAS DE COMPETITION Il n’interfère donc pas avec la formation de complexe ES, cependant il va agir sur la catalyse.

L’enzyme peut donner 2 types de complexes REVERSIBLES binaires ES, EI et un complexe ternaire ESI inactif

Cela va diviser la vitesse maximale, DONC LA REDUIRE.

Pas de modification de Km C’est logique : ça ne gêne pas l’interaction entre l’enzyme et le substrat. On a juste une Vmax APP. On remarque graphiquement que -1/Km n’est pas impacté mais seulement 1/Vmax => Vmax APP

8.5. L’inhibiteur IN-compétitif

L’inhibiteur incompétitif ne peut se mettre que sur le complexe ES, sans pouvoir se lier à l’enzyme libre. La liaison de l’inhibiteur sur un site différent du site actif rend l’enzyme catalytiquement INACTIVE.

Diminution de la Vmax et augmentation de Km. Logique car en quelque sorte il va prolonger la durée de vie du complexe ES On a donc Km APP et Vmax APP R

II. REGULATION DE L'ACTIVITE DES ENZYMES

Il existe beaucoup d’enzymes et de voies métaboliques, d’où le besoin de réguler l’activité des enzymes pour coordonner les voies métaboliques et permettre une adaptation en temps réel.

Il y a deux grandes possibilités de régulation :

- Soit par contrôle de la disponibilité en enzyme (fait intervenir les gènes)

- Soit par contrôle de l’activité enzymatique

II.A. REGULATION PAR MODIFICATIONS COVALENTES DES PROTEINES ENZYMATIQUES

1. Régulation par protéolyse partielle

- Certaines enzymes sont synthétisées sous la forme d’un précurseur inactif : Proenzyme = zymogène.

- Les proenzymes sont clivées au niveau du site d’activation par d’autres enzymes.

- Le trypsinogène est une proenzyme = zymogène.

- L’hydrolyse irréversible de certaines liaisons peptidiques engendre ensuite une enzyme active.

- Ce processus est surtout présent chez les enzymes utilisées par intermittence : (activées dans un environnement, parfois différent de leur site de production).

o Protéases digestives : s’activent suite à un repas.

o Facteurs de coagulation : cascade d’activation protéolytique qui permet une réponse rapide et amplifiée pour former un caillot de sang.

- L’enzyme est présente en permanence dans la cellule mais elle est sous forme inactive, prête à s’activer si besoin.

Exemple : Activation simultanée de zymogènes protéolytiques pancréatiques au niveau du duodénum (segment initial de l’intestin grêle) lors du processus de digestion :

- Le pancréas fabrique des enzymes protéolytiques qui vont être expulsées vers l'intestin, et quand elles y arrivent elles sont activées par une autre enzyme qui les reconnait et qui les clive.

- On a donc une enzyme régulatrice : l'entéropeptidase, qui active d'autres enzymes, à un endroit précis et à un moment précis.

- L'entéropeptidase est une enzyme du duodénum qui initie l'activation en cascade des zymogènes (=proenzymes) en activant le trypsinogène en trypsine. Pour cela, elle reconnaît les pics d'activation du trypsinogène et le clive.

- La trypsine autocatalyse ensuite son activation afin d'amplifier la réponse (elle clive elle-même le trypsinogène en trypsine)

- La trypsine va ensuite catalyser l’activation d’autres enzymes protéolytiques digestives tels que :

o Prolipase → Lipase.

o Proélastase → Elastase

o Chymotrypsinogène → Chymotrypsine

o Procarboxypeptidase → Carboxypeptidase

2. Régulation par fixation de groupes fonctionnels

Certaines enzymes peuvent être régulées par :

o Phosphorylation :

▪ Action d’une Kinase

▪ Addition d’un groupement phosphate (issu de l’ATP) sur les résidus Ser, Thr, Tyr

▪ Modification réversible qui résulte de la formation d’une liaison covalente.

▪ La phosphorylation d’une enzyme n’est pas systématiquement associée à son activation, tout dépend de l’enzyme qui subit la modification post-traductionnelle.

o Déphosphorylation :

▪ Action d’une phosphatase

▪ Réversible

Régulation de la glycogène phosphorylase ;

- Enzyme qui permet de déstocker du glucose en catalysant le clivage phosphorolytique du glycogène en glucose 1-Phosphate :

- La régulation de l'activité de la GP se fait en fonction des besoins en énergie :

o En cas de besoins importants (réserve d'ATP faible : jeûne, activité musculaire intense) :

▪ Elle est activée par phosphorylation du groupement OH d’une sérine par une phosphorylase kinase. Ce groupement phosphate a une répercussion dans l'organisation 3D de l'enzyme et permet de donner au site actif une conformation qui est optimale.

▪ La phosphorylase kinase est activée et la phosphatase 1 est inhibée.

o Si les besoins énergétiques sont faibles :

▪ Inhibition de la phosphorylase kinase et activation de la phosphatase 1.

▪ La GP est désactivée par déphosphorylation par une phosphatase 1.

C’est donc deux enzymes (la phosphorylase kinase & la phosphatase 1) qui régulent la glycogène phosphorylase, qui par la suite va elle-même réguler une autre réaction : le déstockage du glucose.

II.B. REGULATION PAR ALLOSTERIE

1. Enzymes allostériques

- Les enzymes allostériques ont une structure quaternaire oligomérique : Assemblage d’un nombre variable de protomères (sous unités polypeptidiques reliées par des liaisons non covalentes).

- Ces enzymes sont sous la dépendance d'effecteurs se fixant au niveau d'un site allostérique.

- Le « site allostérique » = « site effecteur ».

- Il y a en général un site actif et un ou plusieurs sites allostériques par protomère.

- La protéine peut exister sous deux conformations distinctes : (IMPORTANT !)

L’enzyme allostérique oscille entre deux conformations 3D,

- une appelée tendue,

- l’autre appelée relâchée.

La forme relâchée ou R a une affinité élevée pour l’activateur allostérique ainsi que pour le substrat (km faible).

La forme tendue ou T a une affinité élevée pour l’inhibiteur allostérique mais une affinité faible pour le substrat (km élevé).

Le passage d'une conformation à l'autre se fait par une transition allostérique.

Ces enzymes passent facilement d'une forme très active (R) à une forme très peu active (T)

2. Vitesse initiale et allostérie

- Les enzymes allostériques sont dites non michaeliennes: elles n'obéissent pas à la loi de Michaelis-Menten.

La représentation graphique de v0 en fonction de la concentration en substrat est une sigmoïde et non une hyperbole.

- Attention, on ne peut pas appliquer l’équation de Michaelis-Menten pour calculer la vitesse de réaction car les enzymes allostériques n’ont pas de Km !

- Attention, Une faible variation de concentration en substrat ne provoquera chez l'enzyme michaelienne qu'une faible variation de vitesse. En revanche, pour une enzyme allostérique, pour la même variation de la concentration en substrat, la variation de vitesse est beaucoup plus importante.

En condition physiologique, la [S] ne varie que très peu car ils sont produits et directement consommés.

- Dans le cas où un S doit être consommé immédiatement, une E allostérique pourra faire sa transition allostérique et ainsi répondre aux besoins de l'organisme.

- Les enzymes allostériques peuvent en fait être assimilées à un mélange de 2 enzymes michaeliennes : une à km élevé (état T) et l’autre à km faible (état R).

L'augmentation de [S] fait déplacer l'équilibre de T vers R.

Sur la courbe sigmoïde, le début de la courbe correspond à la forme tendue, alors que dès que la courbe devient presque verticale (la variation de vitesse augmente rapidement) c’est la forme relâchée.

3. Phénomène de coopérativité

La fixation d'une molécule de substrat sur un protomère fait passer celui-ci de l'état T à l'état R : C’est la transition allostérique. Cette transition se répercute forcément de proche en proche aux autres protomères selon 2 modèles:

Certaines enzymes utilisent le modèle concerté tandis que d’autres utilisent le modèle séquentiel.

• Le modèle concerté (Monod) : TT + S S---RR + S S--RR--S

- Le substrat se fixe sur un protomère, ce qui entraine un changement de conformation de l’ensemble des protomères simultanément.

• Le modèle séquentiel (Koshland) : TT + S S--TR--S S--RR--S

- Le substrat se fixe sur un protomère, ce qui entraine le changement de sa conformation et facilite le changement de conformation des autres protomères. (Mais les protomères sont relativement indépendants les uns des autres).

4. Régulation par rétrocontrôle négatif (ou rétro-inhibition ou feedback négatif)

- Pour les enzymes allostériques, l'inhibiteur est souvent un métabolite situé en aval de la voie métabolique.

Exemple de la glycogène phosphorylase (glycogénolyse) :

- La rétro-inhibition est un autre moyen de réguler le clivage du glycogène

- Quand on n’a plus besoin d’énergie, on ne consomme plus le glucose 6-P qui s’accumule et agit alors comme inhibiteur sur la glycogène phosphorylase.

Exemple de la phosphofructokinase PFK1 (glycolyse) :

- Elle est composée de 4 sous-unités et de 4 sites actifs.

- C’est l’enzyme limitante de la voie de la glycolyse cytoplasmique (étape la plus lente).

- La glycolyse permet de produire de l'ATP.

Lorsque l'on n’a plus besoin d'énergie, l’ATP s'accumule et inhibe la phosphofructokinase.

- Régulation par allostérie :

o AMP, quand on a besoin d'énergie, activateur allostérique → déplacement vers la gauche de la cinétique enzymatique. L’AMP permet une transition allostérique qui commence pour une concentration en substrat plus faible que sans AMP ou qu’avec de l’ATP. ➔ L'activateur favorise la transition allostérique vers l'état R pour de très faibles concentrations en substrat.

o ATP, quand on n’a pas besoin d'énergie, inhibiteur allostérique →déplacement vers la droite de la cinétique enzymatique ➔ L'inhibiteur retarde la transition allostérique vers l'état R en favorisant l'état T

III. MESURE DE L'ACTIVITE DES ENZYMES

III.A. PRINCIPE

- La mesure de la concentration en protéine non enzymatique se fait par fixation d'anticorps spécifiques (technique immunologique) eux-mêmes fixés à une protéine qui permet l'émission d'un signal mesurable. On exprime alors la quantité obtenue en unité pondérale (g/L ou mol/L) et on s'intéresse directement à la quantité de matière.

- Le dosage des enzymes ne se fait PAS en quantifiant la protéine enzymatique directement.

- Pour déterminer la concentration d’une enzyme, on utilise en pratique ses propriétés catalytiques. On mesure l’activité catalytique de l’enzyme et la vitesse de la réaction enzymatique dans un milieu, proportionnelle à la concentration en enzyme. Les résultats seront donc exprimés en vitesse (mol.L-1 .min-1 ).

III.B. CONDITIONS EXPERIMENTALES

Les conditions conventionnelles de détermination des activités enzymatiques impliquent des conditions expérimentales où :

o La vitesse de réaction est proportionnelle à la concentration en enzyme.

o La vitesse de réaction n'est pas influencée par les variations en concentration en substrat : on travaillera alors en substrat saturant/en excès de substrat (quand [S] >> km, v0 = vmax et vmax = kcat [E]0).

En pratique :

o Concentration du substrat : ▪ Pour être à vmax en pratique [S] doit être > ou = 10 km ▪ Quand S=10 km, on est à 91% de la vmax = 10/11 de la vmax;

o Utilisation d'un substrat naturel ou de synthèse : ▪ Bonne solubilisation ▪ Km faible

▪ Utilisation d’un substrat chromogène. Par exemple, qui donnera un signal coloré et permettra de mesurer une absorbance qui va varier et va permettre de mesurer la v0. o Travail à pH optimum: en milieu tamponné. Le but c'est que le pH n'influe pas sur la mesure de l'activité de l'enzyme et que ce ne soit que la v0 qui soit mesurée.

o Thermostatisation (= température stable) à température optimale (souvent 37°C)

III.C. MODALITES DE MESURE

- La variation de la concentration en produit et en cosubstrat est calculée par la mesure de la variation d'absorbance du milieu réactionnel par unité de temps (signalisation du produit ou d'un co-substrat).

- La mesure est réalisée grâce à un spectrophotomètre, le temps de mesure est très court (de quelques dizaines de secondes à quelques minutes), et la mesure est réalisée en cinétique (plusieurs mesures à intervalles réguliers sur des temps très court).

- Pour pouvoir mesurer l’absorbance, il nous faut soit un substrat de synthèse avec un chromogène, soit une espèce qui absorbe naturellement la lumière : c’est le cas du coenzyme d’oxydoréduction NAD+ qui dans sa forme réduite absorbe à une longueur d’onde de 340nm

- La mesure en cinétique permet de tracer la courbe de manière précise et voir à quel moment on est en situation de vitesse initiale.

Calcul de la vitesse initiale : La loi de Beer-Lambert montre qu’il y a une proportionnalité entre l’absorbance et la concentration de la molécule qui absorbe.

Les calculs avec la loi de Beer Lambert sont faits par des automates, avec l qui correspond au trajet optique (taille de la cuve, souvent 1 cm) et ε qui est le coefficient d’absorptivité molaire/ coefficient d’extinction molaire (qualité d’une molécule donnée à absorber la lumière). On peut alors déterminer une vitesse.

III.D. RESULTATS

Unités d’activité enzymatique :

o UI ou U (ex unité internationale) : quantité d'enzyme catalysant la transformation d'une micromole de substrat par minute : umol.min-1

o Katal (unité du SI) : quantité d'enzyme catalysant la transformation d'une mole de substrat par seconde : mol.s-1

- L'UI est encore très utilisé en biologie médicale, car plus adapté que le Katal qui est bien trop important pour les réactions biologiques.

Attention, il est facile de tomber dans le piège entre UI = Unité internationale et Katal = Unité du système international !

- Les résultats catalytiques sont donc exprimés en UI.L -1 ou nKat.L -1 : concentration catalytique, ou concentration d'activité enzymatique, et pas concentration molaire.

- La concentration d’activité enzymatique est homogène à la vitesse initiale (UI.L -1 = μmol.L-1 .min-1 ).

III.E. INTERET MEDICAL

• Diagnostic biologique : - Cytolyse hépatique (hépatite virale ou toxique) : libération massive d'enzymes cytosoliques dans le sérum. → Élévation de la concentration d'activité sérique des enzymes spécifiques du foie ALAT et ASAT. On mesure donc l'élévation de leur concentration d'activité enzymatique dans le sérum pour poser le diagnostic.

o Ex: intoxication au paracétamol toxique pour le foie.

- Cytolyse pancréatique (pancréatite aiguë = inflammation du pancréas) : élévation de la concentration d’activité sérique de la lipase.

• Suivi biologique - Médicaments hépatotoxiques provoquant une cytolyse hépatique : (élévation de la concentration de l’activité sérique d’ALAT et ASAT).

IV. LES ISOENZYMES ET LEUR INTERET EN BIOLOGIE

- Les isoenzymes sont des enzymes :

o Catalysant la même réaction sur le même substrat.

o Ayant une structure protéique différente.

o Une cinétique différente (Kcat et Km).

o Souvent, une répartition différente dans l'organisme.

o Une affinité différente pour le substrat d'un organe à l'autre. 1UI = 16,6 nKat. 

Rôle des isoenzymes: les différences d’affinité pour le substrat permettent une modulation de l’activité enzymatique en fonction du tissu.

→ Régulation spécifique à des tissus différents ou à des moments de développement différents.

→ Permet une meilleure adaptation au métabolisme pour répondre aux besoins d’un tissus.

Exemple : la lactate déshydrogénase :

- C'est une enzyme tétramérique constituée de 2 protomères différents : H (heart → muscle cardiaque) et M (muscles squelettiques et foie).

- Les différentes associations de protomères conduisent à 5 isoenzymes différentes : H4 (surtout dans le cœur), H3M, H2M2, HM3, M4 (surtout dans le foie). → Par exemple une augmentation de H4 veut dire qu’on a eu un infarctus du myocarde.

- La mesure d'activité d'une isoenzyme peut servir à renseigner sur l'état du tissu dont elle est spécifique, mais cette technique reste peu utilisée car des techniques plus récentes ont prouvé plus d'efficacité.

Exemples d'utilisations encore d'actualité :

- Dosage sérique de l'isoenzyme osseuse de la phosphatase alcaline (PALos) dans certaines pathologies affectant l'os.

o Il s'agit ici d'un contre-exemple car la plupart des techniques qui permettent de doser ces enzymes se font grâce à des techniques immunologiques et pas grâce à la mesure de la vitesse initiale.

- Dosage de l'isoenzyme cardiaque de la créatine kinase (CKMB (plutôt dans le cœur), CKBB, CKMM) lors de l'infarctus du myocarde.

o Le dosage de la CKMB pour détecter l'infarctus du myocarde a été supplanté par le dosage de la troponine.

V. COENZYMES ET VITAMINES

Rappels: Holoenzyme = apoenzyme + cofacteur(=coenzyme ici).

Les cofacteurs peuvent être des ions métalliques (Zn2+, Mg2+), des groupements prosthétiques (ou coenzymes vrais) ou des coenzymes mobiles (ou cosubstrats).

Les coenzymes sont souvent des dérivés vitaminiques, nécessitant un apport alimentaire. (Donc des carences alimentaires peuvent entrainer des dysfonctionnements de certaines enzymes)

V.A. CARACTERISTIQUES GENERALES DES COENZYMES

Les coenzymes sont des composés :

o De nature non protéiques,

o Organiques,

o De faibles masses moléculaires,

o Thermostables,

o Ils n'assurent pas la spécificité enzymatique. (Une même coenzyme peut intervenir dans des réactions catalysées par des enzymes différentes) mais ont le rôle de site catalytique (transfert de groupements, oxydo-réduction...),

o Ils sont cependant différents des substrats, car ils retrouvent leur état initial à la fin de la réaction, tandis que le substrat est transformé.

Fonctionnement :

• Groupements prosthétiques: - Un groupement prosthétique reste fixé sur la même apoenzyme durant toute la réaction (liaison covalente = forte). - CoE d'oxydo-réduction liée à l'apoenzyme par une liaison covalente. Elle va réagir avec un premier substrat dont elle permet l'oxydation en se transférant deux molécules d'hydrogène.

Pour revenir à son état initial le transfert se fait vers un 2nd substrat qui sera réduit.

• Co-substrats - Un cosubstrat se fixe à une 1ère enzyme pour catalyser une réaction, puis a une 2ème pour catalyser la réaction inverse et retrouver son état initial.

- Le cosubstrat n’est PAS fixé à l’enzyme, il s’y lie par des liaisons faibles et s’en détache pendant la réaction.

V.B. ROLE METABOLIQUE

Exemple : La vitamine B12 et les folates (vitamines B9) : - Ce sont deux cofacteurs qui interviennent dans la synthèse d'ADN, plus précisément dans la synthèse de la thymidine.

- La thymidilate synthétase utilise un dérivé tétrahydrofolate (dérivé de la vit B9) comme coE.

Ce dérivé est obtenu suite à une première réaction qui est la synthèse de la méthionine grâce à la méthionine synthase (transfert de groupement méthyle) qui utilise comme coE la vitamine B12.

- Il y a une intrication métabolique de ces deux coE.

- Si déficit dans l'apport d'une des deux vitamines → déficit dans la production de thymine → déficit de production de l'ADN → 1° tissu touché : tissu avec une forte activité de division, c'est-à-dire les tissus hématopoïétiques → anémie (déficit d'hémoglobine dans le sang qui se manifeste par pâleur et essoufflement)

- Un déficit en vit B9 chez la femme enceinte peut provoquer des malformations du système nerveux central chez les enfants.