La cinétique des enzymes c'est l'étude des vitesses de réactions et de leurs modifications en réponse aux changements des conditions expérimentales.

Cela permet :

• La modélisation de l'activité enzymatique
• L'étude en présence d'inhibiteurs
• La recherche des conditions optimales

Les techniques courantes pour mesurer la vitesse de la réaction

• Spectrophotométrie (ex : NADH, cf TP glucose)
• Colorimétrie (ex: Quinone, cf TP glucose)
• Fluorimétrie
• Radioctivité
• pHmétrie

Quand on mesure la vitesse de réaction, on mesure l'apparition de P, la disparition de S et l'apparition/disparition du coenzyme en fonction du temps.

Lors de la mesure :

• La phase I est quasiment linéaire
• La phase II est représenté par une inflexion de la droite par l'epuisement de S, l'inactivation de E et une grande quantité de P

Pour comparer différents cinétiques enzymatiques, on compare les Vi (vitesse initiale)

Influence des différents paramètres de la réaction

• Les paramètres physico-chimiques : température et pH
• Les différents partenaires de la réaction : [E] et [S]

L'influence de la température à 2 effest antagonistes :

• L'effet activateur => Augmentation de l'agitation des molécules (substrat) et de la réactivité
• La thermodénaturation => Destruction des liaisons faibles (perte de la structure spatiale native)

L'influence du pH apporte des modifications de l'état d'ionisation des résidus dissociables :

• Changement de conformation de la protéine
• Modification du site catalytique (perte ou gain de liaisons H et/ou ioniques)
• Modification du nb/répartition des charges

L'influence de la concentration en enzyme [E] : Graphique moodle CM3

L'influence de la concentration en enzyme [S] : Graphique moodle CM3

Cinétique michaelienne

Complexe enzyme-substrat

Constante de Michaelis

• Constante de dissociation du complexe ES
• Constante de Michaelis

Equation de Michaelis - Menten

Evolution selon S

Evolution selon E

Signification de Vmax

• Se mesure quand [S]>>Km (conditions saturantes)
• Mesures d'activité enzymatique au laboratoire

Signification physique de Km

• Force de liaison du complexe = affinité de E pour S
• Km est d(autant plus élevée que la dissociation du complexe est forte et donc que l'afffinité de E pour S est faible
• Signification biochimique de Km : [S] nécessaire pour atteindre 50% de la Vmax

=> Kcat/Km => Mesure de l'efficacité catalytique (constante de spécificité)

La constante catalytique : Kcat

• Turn over number : Kcat = Vmax/[Et]
• Nombre max de molécule de S par seconde et par molécule d'enzyme => efficacité de l'enzyme
• Fréquence à laquelle l'enzyme établit l'acte catalytique lorsqu'elle est saturée en S => + Kcat est grand, + le nombre d'actes catalytiques est grand
• 1/Kcat : durée de l'acte catalytique lorsque l'enzyme est saturée en S => + l'acte catalytique est rapide, + le nombre de turn over est grand

Comment déterminer Km et Vmax

• Linéatisation de la relation de Michaelis-Menten (représentation en double inverse)

Représentation de Lineweaver et Burk