Le clonage moléculaire est une technique utilisée en biologie et en génétique pour produire de multiples copies identiques d'un gène ou d'une séquence d'ADN. Cette technique a révolutionné la biotechnologie en permettant la manipulation génétique et la production de protéines recombinantes à grande échelle.

Principes du clonage moléculaire

Le clonage moléculaire implique plusieurs étapes clés :

-1. Extraction de l'ADN : La première étape du clonage moléculaire consiste à extraire l'ADN à partir de la source choisie. Cela peut être un organisme, une cellule ou une séquence spécifique d'ADN. L'ADN est isolé à l'aide de diverses méthodes, telles que l'extraction au phénol-chloroforme ou par utilisation de kits de purification commerciaux.

2. Amplification du gène: Une fois l'ADN extrait, le gène d'intérêt est amplifié par réaction en chaîne par polymérase (PCR). La PCR permet de produire rapidement de nombreuses copies du gène, en utilisant des amorces spécifiques qui se lient aux extrémités du gène cible. Cette étape permet d'obtenir une quantité suffisante de matériau génétique pour la suite du processus.

3. Construction du vecteur: Une fois le gène amplifié, il est inséré dans un vecteur, tel qu'un plasmide ou un virus. Le vecteur est un support qui permet l'introduction du gène dans un organisme hôte, où il pourra être répliqué. Le vecteur est manipulé en laboratoire pour y insérer le gène d'intérêt, généralement grâce à des enzymes de restriction et à la ligature d'ADN.

4. Transformation de l'organisme hôte: Une fois le vecteur construit, il est introduit dans un organisme hôte, tel que des bactéries ou des cellules animales. Cela peut se faire par transformation bactérienne, par micro-injection dans les cellules animales, ou par d'autres méthodes de transfert génétique. L'organisme hôte reproduit alors le vecteur contenant le gène d'intérêt, permettant la production de nombreuses copies du gène.

Définition

Clonage moléculaire

Clonage de l'ADN qui permet de préparer de grandes quantités de molécules ADN identique

ADN recombinant

L'ADN recombinant est un ADN formé par la fusion de fragments d'ADN provenant de différentes sources.

Vecteur ADN

Le vecteur ADN est un élément génétique qui peut être transféré d'une cellule à une autre et qui peut se repliquer.

Les enzyme de restrictions: endonucléase

Rôles:

découpent un fragment ADN d’intérêt à des sites spécifiques de 4 à 12 bases (taille différentes)
découpent le vecteur de clonage pour permettre l'insertion du fragment.
Type HIND II ou ECORI
Reconnaît les sites de restrictions palindromes (5'-3')
Coupe la liasion phosphodiester ( 3'-

Ligature: ADN ligase

Rôles:

Lier les 2 fragments ADN coupés
Catalyse la formation de liaison phosphodiester entre les groupement phosphate et hyroxyle.

Insertion d'un fragment ADN dans un vecteur clonage

vecteur : Les plasmides (10 000pb) molécule ADN circulaire, extrachromosomique, multiplication autonome = idéale / Phage (10-25000pb)
Comporte : Une origine de réplication (ORI) , une région à site de clonage multiple (SMC/MCS) : clivage et insertion
Gène de résistance (AMP)
voir schéma gène lacZ (bleu)