5.6 Methodes d’études des Virus

Les virus font l’objet d’études :

-Qualitatives : organisation interne des particules virales, événements aboutissant à la production des virions

-Quantitatives : estimation de la quantité de virions produite au cours des cycles de multiplication.

1) Culture des virus

Obligatoirement cultivés dans les cellules vivantes :

-Soit sur des organismes entiers

-Soit en culture de cellules

1.1 Utilisation des organismes entiers :

1.2 Utilisation de cultures in vitro :

Inoculation des cultures in vitro :

 -Directe (Mise en contact virus et cellules)

 - Inoculation de l’acide nucléique viral (Microinjection dans le noyau de la cellule/ PEG + ions divalents (Ca2+)/ Fusion avec les liposomes/ Electroporation/Bombardement avec canon à particules)

Culture de virus pas ou très peu utilisé en diagnostic

-Méthode lente

-Laboratoires hospitaliers non équipes

-Diagnostic à partir des symptômes patient

-Tests sérologiques plus pratiques

2) Purification des virus :

Multiplication dans des cellules = Broyage des cellules dans un tampon d’extraction = Suspension aqueuse ou homogénat à purifier

Centrifugation

 - Centrifugation différentielle

 -Centrifugation isopycnique

3) Titrage des virus

Détermination du nombre de virus

Dénombrement des Particules virales                

Dénombrement des unités infct

Determination du nombre d’unites infectieuse: On compte le nombre de lyses infectieux ou d’unités forman plage (UFP)

4) Méthodes d’étude physico-chimiques

Elles permettent de déterminer les principaux paramètres caractérisant un virus et certains aspect de la réplication de l’ANV.

4.1 Microscopie électronique :

4.1.1 Observation du virion

Techniques de coloration

Techniques immunocytochimiques

4.1.2 Observation des acides nucléiques :

Technique de Kleinschmidt = Enrobage des AN par une protéine basique

Technique de Dubochet = Etalement des AN sur une grille de microscopie électronique chargée +.

4.2 Techniques d’immunofluorescence

Mise en évidence de cellules infectées par un virus au sein des prélevements : fragments d’organes, sécretions

Utilisation d’Ac spécifiques de chacun des virus suspectés couplés à un fluorochrome.

4.3 Techiques de biologie moléculaire

4.3.1 Techniques d’hybridation simple :

Données qualitatives = Parenté entre deux ADN ou entre un ADN et un ARNm

Données quantitatives = quantité d’AN hydridée

4.3.2 Techniques d’hybridation compétitives :

Distinction ARNm précoces et tardifs

Polarité des ARN : + ou -

Agencement gènes viraux

Techniques de génie génetique

Northern-Blot

Western-Blot = Méthodes d’hybridation

4.3.3 Etude cinetique de la renaturation d’un ADN

Degre de répetition des séquences d’ADN = complexité du génome

4.4 Autres techniques

Diffraction des rayons X = Organisation protéines virales/Structure 3D

Electrophorèse = Gel d’agarose (ANV) = Gel de polyacrylamide