On a quatre groupes différents en fonction du risque infectieux (du moins dangereux au plus dangereux). On n'a aucune bactérie dans le groupe 4.

Voies de contamination :

• aérienne

• cutanée et oculaire

• orale

• percutanée

Les entérobactéries :

- Bacille à Gram -

- Pousse sur un milieu ordinaire

- Production de gaz (avec ou sans production de gaz)

- Mobile (péritriche = flagelle sur toute la bactérie) ou immobile (Klebsiella)

- Aéro-anaérobie facultatif

- Nitrate réductase (nitrate en nitrite)

- Oxydase -

- Catalase +

Si catabolise de lactose on dit lac +, ce sont les coliformes

souvent hétérotrophe donc il faut leur donner de quoi se développer : C,N,P,K, vitamine , énergie , ect ... + autre condition de croissance ( température , PH, phase gazeuse , lumière ,ect ...).

• Milieux liquide (bouillon)

constituant dilué dans de l'eau distiller

• Milieux solide :

milieux liquide + agent gélifiant :

► agar, agar noble: polysaccharide d'algues rouges, le plus commun (15 g/l)

► gel de silice : culture d'autotrophes (CO2 = source de carbone)

► gel de gellane : thermostables donc pour la culture d'hyperthermophiles

Sélection des micro-organisme :

milieux riche non sélectif = le plus possible→10 < nbre colonies/ boîte < 300

milieux sélectif = certain seulement →10 < nbre colonies/ boîte < 150 :

Composition particulière → pression de sélection →du milieu croissance de certains microorganismes favorisée

Formes des cultures :

Formes et mode de groupement des cellule bactérienne :

Caractéristique métabolique :

• le type respiratoire

•capacité à utilisé les glucide (glucose / lactose )

•capacité à utilisé protéine et acide aminé

•présence d'enzyme particulière

→ βgalactosidase : hydrolyse du lactose

→ tryptophanase : production d’indole

Les bactéries hétérotrophes peuvent respirer et/ou fermenter .

• Dilution en cascade et étalement sur gélose :

On utilise Escherichia colis →10⁰ = solution mère

Préparation de dilutions successives au1/10 dans du tryptone sel (de 10^-1 à 10^-4). Changer de pipette à chaque dilution (10-1 vers 10-4).

Pour chaque dilution retenue, étalement de 0,1ml d’inoculum sur la gélose deux fois , à partir de la dilution la plus diluée (10-4 vers 10-1).

Limite et erreur possible :

Certaines bactéries floculent, ce qui rend impossible le dénombrement sur gélose

•Si pour une même dilution (2 boîtes), une seule boîte correspond aux limites données, il faut éliminer les deux boîtes dans le calcul (ne pas le faire avec une seule boîte)

•Si une seule dilution (2 boîtes) est correcte, ne prendre que cette dilution

Calcule :

N = (Σc) / (v.(1.n1+0,1.n2).d)

avec :

c : nombre de colonies sur toutes les boîtes comptées

v : volume inoculé

n : nombre de boîtes retenues pour la dilution (n1= pour la 1 ère dil comptée ; n2 = pour la 2 nd dil..)

d : dilution la plus faible (la 1ère) (100 = 1; 10-1 =1/10 = 0,1; 10-2 = 1/100 = 0,01…)

• Coloration de gram principe

rose = Gram-

violet = Gram +

• Technique du cadran 

Faire stries serrées et flamber anse/pipette entre chaque cadran

• Antibiogramme

- S’applique à une souche pure

- Permet d’identifier plusieurs résistances

- Permet d’évaluer le niveau de sensibilité

Permet d’apprécier l’efficacité d’une molécule par mesure de l’inhibition de croissance et de sa CMI: concentration minimale inhibitrice

technique d'ensemencement

prélever 3mL de suspension d'Escherichia colis → inonder la gélose TSA → Reprendre le surplus de suspension bactérienne et laisser sécher15 min près du bec bunsen→ Déposer les 3 disques avec une pince stérile et appuyer doucement→ 24 à 48H à 37°C

Mesure des résultats :

-Mesurer les diamètres d’inhibition et les rapporter sur le tableau de lecture en reportant celui-ci sur l’abaque de référence pour la molécule antibiotique

But:

•déterminer si la souche est sensible (S), résistante (R) ou présente une sensibilité intermédiaire (I)

Résistance aux antibiotique :

On a différente technique pour créer une résistance face aux antibiotiques :

►Production d’une enzyme modifiant ou détruisant l’antibiotique

►Imperméabilisation de la membrane de la bactérie

►Pompes refoulant l’antibiotique vers l’extérieur

►Modification de la cible de l’antibiotique

►Substitution de la cible par une autre

• Gélose viande foie:

• Apres régénération de la gélose VF qui sera maintenue en surfusion à 45°C, ensemencer la gélose liquide à l’aide d’une pipette Pasteur effilée

• Plonger la pipette stérilisée à la flamme au fond du tube et remonter en faisant un mouvement de vrille (spirale)

• Revisser le bouchon et mettre le tube sous l’eau du robinet pour refroidir la gélose qui va se solidifier et piéger les bactéries

• Dévissez légèrement le bouchon pour l’incubation à 37°C, 24h

►la bactérie poussera différemment en fonction de son mode respiratoire :

Concentration en oxygène:

► aérobiose, aérobie

► anaérobiose, anaérobie

• Organismes aérobies stricts :

→Respiration aérobie oxygène = accepteur final d’électrons =

certains Pseudomonas-Micrococcus : + O2 respiration aérobie

•Organismes aérobies anaérobies facultatifs

→ peut se développer en absence d’oxygène mais meilleure croissance en aérobiose : Respiration aérobie vs fermentation ou respiration anaérobie =

E. coli : + O2 respiration aérobie (ox -) / -O2 respiration anaérobie ou fermentation (voie des acides mixtes)

Aeromonas : + O2 respiration aérobie (ox +) / -O2 fermentation

Ps. aeruginosa : + O2 respiration aérobie (ox +) / -O2 respiration anaérobie (réduction du nitrate)

•Anaérobies aérotolérants

→ croissance identique avec et sans oxygène =

Lactobacillus acidophilus : -O2 fermentation (fermentation lactique) / + O2 superoxide dismutase

•Anaérobies stricts ou obligatoires

→meurent en présence d’oxygène =

Methanococcus (archée méthanogène) : respiration anaérobie (réduction du CO2 en méthane CH4)

Desulfovibrio : respiration anaérobie (réduction du sulfate en sulfure) Bacteroides : fermentation 

• Test du métabolisme glucidique

On a 2 milieux :

• Gélose EMB (Eosine & Methylene Blue )

On utilise la technique des cadrans

► utilise un milieu différentiel légèrement sélectif qui permet d'identifié les coliformes :

- Bleu de méthylène : inhibite la plupart des bactéries Gram+

- Eosine devient noire en milieu acide

- Lactose fermenter si coloration noir à noir avec reflet vert "scarabée"

→fermente si l'utilise

Assimilation du lactose→ Production d’acides → Acidification du milieu →Modification de l’indicateur coloré→ colonie violette / noir

• Milieu Kligler-Hajna

Identification des espèces d’entérobactéries catabolisant le lactose, fermentant le glucose et productrices de gaz (dont CO2 et/ou H2 , et H2S) , avec un milieux différentiel contenant : Rouge de phénol (indicateur coloré de pH) ,Glucose (1g/L) , Lactose (10g/L) , Thiosulfate et Citrate de fer

► Ensemencement de la pente (en stries )

►et du culot (piqûre droite )

sachant que le glucose est toujours utilisé avant le lactose et que la voie oxydative produit moins d’acides que la voie fermentaire on aura utilisation du glucose au fond et de lactose sur la pente ( en fonction de si la bactérie les utilise ou pas )

Résultat :

►pente aérobie = respiration

→jaune = acidification (lactose+)

→rouge = pas d'acidification (lactose-)

►culot anaérobie = fermentation

→jaune = acidification (glucose+)

→rouge = pas d'acidification (glucose-)

► présence d'un culot donc bactérie anaérobiose

►Le sulfure d'hydrogène réagit avec les ions fer III (Fe3+) du citrate de fer pour former un précipité de sulfure de fer noir (FeS).

► Bulle , décollement du culot ou fragmentation de gélose traduit un dégazement et donc la production de gaz (H2 et/ou CO2)

• Test du métabolisme protéique

2 milieux différent :

•milieu APP (phénylalanine)

permet d'identification des bactéries possédant une phénylalanine désaminase

résultat :

on a production de fer si :

►Pente verte après ajout de perchlorure de fer

►Phénylalanine donnera Acide Phényl Pyruvique (Test APP)

►APP réagit avec Fe3+ (ion ferrique) et donne complexe coloré (en vert )

on a production de gaz si :

► dégazement = formation de bulle , décollement du culot ou fragmentation de la gélose

• milieux EPS (Eau peptonée sans Indole)

→milieu liquide ensemencer puis on ajoute après incubation quelque goutte de réactif de kovacs

Résultat :

on a présence de tryptophanase si :

► formation d'un anneau rouge en présence du réactif

• test ONPG (Ortho-nitrophényl-b-galactoside)

permet d'identifier les bactéries capables d'hydrolyser le lactose mais moins rapidement que d'autre et qui n'est pas forcément visible dans un milieu lactose comme Kligler-Hajna .

→Permet de déterminer si non assimilation du lactose est bien due à absence de β-galactosidase (et pas à celle de lactose perméase)

Technique d’ensemencement:

prélever quelque colonie du milieu Kligler-Hajna , faire une suspension bactérienne dans de l'eau distillé et ajouter un disque ONPG et laisser incuber 1h a 37°C

Résultat:

coloration jaune = lactose +

• Test catalase

utilisé pour distinguer les bactéries bacille et coque Gram + .

→Les sous produits de la réduction de l’O2 en H2O sont très toxiques pour les bactéries qui doivent pouvoir les éliminer sous forme de bulle

Technique d’ensemencement:

-déposer un prélèvement de colonie dans une goutte d'H₂O₂

Résultat :

• La catalase est une enzyme qui catalyse la dismutation de l’eau oxygénée (peroxyde d'hydrogène) en O2 + H2O , ce qui provoque une réaction chimique la formation de bulle a la surface de la colonie

► si bulle : gram +

►sans bulle : gram -

• Test oxydase

utilisé pour distinguer les bactérie bacille et coque Gram -

il y 2 type de chaîne respiratoire chez les bactéries :

•Oxydase +: souche possédant le complexe cytochrome c oxydase = Gram -

•Oxydase- : souche possédant le complexe cytochrome o oxydase (certaine Ox- n'ont pas de chaîne)

Technique d’ensemencement:

Déposer le prélèvement de colonie ( prélever sur milieu solide ) sur un patch ou une bandelette Ox , attendre quelque seconde

Résultat :

coloration rose = gram -

aucune coloration = gram +

•Test de la coloration de gram

permet de vérifier les résultat du test oxydase et catalase

Technique d’ensemencement:

déposer un prélèvement sur lame et observer au microscope