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Traçabilité moléculaire
Définitions
Principe d'Illumina
Approches multilocus:
a- VNTR ou Minisatellites:
- séquence répétée en tandem un nombre x de fois de 10 à 50 paires de bases. Ce sont des marqueurs de dominance.
- détection par Southern Blot après hydridation avec la sonde du microsatellite
- obtention d'une empreinte génétique ou fingerprint propre à chacun et selon la filiation (sauf vrais jumeaux ou le profil est quasi-identique).
b- STR ou Microsatellites:
- séquence répétée en tandem un nombre x de fois de 2 à 5 paires de bases
- même révélation (southern blot avec electrophorèse, transfert, hydridation avec la sonde et autoradiographie)
c- AFLP ou Amplified fragment length polymorphism:
- PCR nécessitant l'utilisation d'enzymes de restriction et d'adaptateurs
- l'amplification ne marche que si l'extrémité en 3' est correctement fixée et scellée par la ligase
- joue sur la complémentarité des adaptateurs à un fragment, dans le but d'amplifier celui-ci par l'ajout d'extrémités artificielles
- révélation par électrophorèse
d- RAPD ou Random amplified polymorphism DNA:
- PCR avec une amorce d'une dizaine de nucléotides (très courte) donc la séquence à été choisie au hasard
- hybridation au hasard sur plusieurs régions du génome
- révélation par électrophorèse
Approches pour des mutations ponctuelles ou SNP:
a- Séquençage:
- technique de Sanger= 1 amorce de 20 nt + ADN à séquencer + 4 dNTP dont 1 marqué + l'ADN polymérase + 4 ddNTP (arrêtent l'incorporation dans les 4 tubes)
- lecture sur le gel et/ ou obtention d'un signal lumineux
b- NGS ou Next Generation Sequençing:
- Pyroséquençage= adaptateur en 5' et 3', ADN fragmenté, billes (émulsion) contenant le matériel pour la PCR (enzymes et nucléotides nécessaires pour le séquençage+ amorces et nt fluorescehts marqués par fluorophores différents+ enzymes nécessaires à la réaction+ substrat de ces enzymes). L'amplification de l'ADN a lieu dans chaque goutte. +++ copies par bille et 1 bille/ puit
- Illumina= PCR sur un support solide. (amplification locale) Identification simultanée des bases d'ADN lorsqu'elles sont incorporées dans la chaîne d'acides nucléiques par émission d'un signal de fluorescence unique
À retenir :
Les techniques utilisées pour une identification multilocus sont les minisatellites ou VNTR, les microsatellites ou STR, les AFPL et les RAPD.
Pour identifier des modifications ponctuelles, on préférera le séquençage (ex: de Sanger) ou alors les nouvelles techniques de séquençage ou NGS comme le pyroséquençage ou Illumina
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Traçabilité moléculaire
Définitions
Principe d'Illumina
Approches multilocus:
a- VNTR ou Minisatellites:
- séquence répétée en tandem un nombre x de fois de 10 à 50 paires de bases. Ce sont des marqueurs de dominance.
- détection par Southern Blot après hydridation avec la sonde du microsatellite
- obtention d'une empreinte génétique ou fingerprint propre à chacun et selon la filiation (sauf vrais jumeaux ou le profil est quasi-identique).
b- STR ou Microsatellites:
- séquence répétée en tandem un nombre x de fois de 2 à 5 paires de bases
- même révélation (southern blot avec electrophorèse, transfert, hydridation avec la sonde et autoradiographie)
c- AFLP ou Amplified fragment length polymorphism:
- PCR nécessitant l'utilisation d'enzymes de restriction et d'adaptateurs
- l'amplification ne marche que si l'extrémité en 3' est correctement fixée et scellée par la ligase
- joue sur la complémentarité des adaptateurs à un fragment, dans le but d'amplifier celui-ci par l'ajout d'extrémités artificielles
- révélation par électrophorèse
d- RAPD ou Random amplified polymorphism DNA:
- PCR avec une amorce d'une dizaine de nucléotides (très courte) donc la séquence à été choisie au hasard
- hybridation au hasard sur plusieurs régions du génome
- révélation par électrophorèse
Approches pour des mutations ponctuelles ou SNP:
a- Séquençage:
- technique de Sanger= 1 amorce de 20 nt + ADN à séquencer + 4 dNTP dont 1 marqué + l'ADN polymérase + 4 ddNTP (arrêtent l'incorporation dans les 4 tubes)
- lecture sur le gel et/ ou obtention d'un signal lumineux
b- NGS ou Next Generation Sequençing:
- Pyroséquençage= adaptateur en 5' et 3', ADN fragmenté, billes (émulsion) contenant le matériel pour la PCR (enzymes et nucléotides nécessaires pour le séquençage+ amorces et nt fluorescehts marqués par fluorophores différents+ enzymes nécessaires à la réaction+ substrat de ces enzymes). L'amplification de l'ADN a lieu dans chaque goutte. +++ copies par bille et 1 bille/ puit
- Illumina= PCR sur un support solide. (amplification locale) Identification simultanée des bases d'ADN lorsqu'elles sont incorporées dans la chaîne d'acides nucléiques par émission d'un signal de fluorescence unique
À retenir :
Les techniques utilisées pour une identification multilocus sont les minisatellites ou VNTR, les microsatellites ou STR, les AFPL et les RAPD.
Pour identifier des modifications ponctuelles, on préférera le séquençage (ex: de Sanger) ou alors les nouvelles techniques de séquençage ou NGS comme le pyroséquençage ou Illumina
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