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Post-Bac
4

Sondes nucléotidiques et marquages

Génie génétique

Définitions

Sonde
Fragment d'ADN ou ARN simple brin qui permet de révéler spécifiquement et après hybridation une séquence d'ADN qui lui est complémentaire

Exemple de sonde

Nick translation (ou translation de brèches):

Utilisation de:

  • la DNase I pour générer des coupures simples brins
  • l'ADN pol I + 4 dNTP dont 1 marqué pour dégrader l'ADN en 5'-3' au niveau de ces coupures et repolymériser avec le nucléotide chaud. 
  • pour récupérer la sonde: passage sur colonne filtration sur gel


Random Priming ou Oligolabelling (ou multi-amorçage):

  • séparation des deux brins de la sonde par chauffage (dénaturation)
  • hybridation avec un mélange d'amorces de 6 nucléotides
  • ajout du fragment de Klenow + 4 dNTP dont 1 marqué
  • pour récupérer la sonde: gel filtration, puis dénaturation, hybridation, ...


PCR:

  • Taq Polymérase + 4 dNTP dont 1 radioactif + sonde
  • dénaturation, hybridation, élongation
  • gel filtration


Marquages en 5' ou en 3':

  • En 3': sonde + la terminal transfèrase + 1 nucléotide marqué
  • En 5': sonde + polynucléotide kinase + 1 ATP au Phosphate marqué


Rappels concernant l'hybridation:

Le Tm= température à laquelle on a 50% d'hydridation (50% sb et 50% db)

Il dépend de la composition et de la longueur du fragment, et de la salinité du milieu

Il est égal à: Tm= 2* (A+T) + 4*(G+C)


Pour rappel, à 260 nm, l'ADN sb absorbe plus que le double brin car les bases sont plus accessibles donc DO sb > DO db

1 DO à 260 nm= 50 µg/ml d'ADN db ou 35 µg/ml d'ARN sb car ARN= plus instable


À retenir :

A retenir:

sondes nucléotidiques, random priming ou oligolabelling, nick translation, pcr, terminal transferase, polynucléotide kinase


Site utile:

http://acces.ens-lyon.fr/biotic/biomol/outilsbm/html/marqsond.htm#:~:text=Marquage%20par%20translation%20de%20coupure(Nick%20Translation)%20%3A&text=I%20pour%20d%C3%A9grader%20l'ADN,pr%C3%A9sence%20d'un%20nucl%C3%A9otide%20chaud.



Post-Bac
4

Sondes nucléotidiques et marquages

Génie génétique

Définitions

Sonde
Fragment d'ADN ou ARN simple brin qui permet de révéler spécifiquement et après hybridation une séquence d'ADN qui lui est complémentaire

Exemple de sonde

Nick translation (ou translation de brèches):

Utilisation de:

  • la DNase I pour générer des coupures simples brins
  • l'ADN pol I + 4 dNTP dont 1 marqué pour dégrader l'ADN en 5'-3' au niveau de ces coupures et repolymériser avec le nucléotide chaud. 
  • pour récupérer la sonde: passage sur colonne filtration sur gel


Random Priming ou Oligolabelling (ou multi-amorçage):

  • séparation des deux brins de la sonde par chauffage (dénaturation)
  • hybridation avec un mélange d'amorces de 6 nucléotides
  • ajout du fragment de Klenow + 4 dNTP dont 1 marqué
  • pour récupérer la sonde: gel filtration, puis dénaturation, hybridation, ...


PCR:

  • Taq Polymérase + 4 dNTP dont 1 radioactif + sonde
  • dénaturation, hybridation, élongation
  • gel filtration


Marquages en 5' ou en 3':

  • En 3': sonde + la terminal transfèrase + 1 nucléotide marqué
  • En 5': sonde + polynucléotide kinase + 1 ATP au Phosphate marqué


Rappels concernant l'hybridation:

Le Tm= température à laquelle on a 50% d'hydridation (50% sb et 50% db)

Il dépend de la composition et de la longueur du fragment, et de la salinité du milieu

Il est égal à: Tm= 2* (A+T) + 4*(G+C)


Pour rappel, à 260 nm, l'ADN sb absorbe plus que le double brin car les bases sont plus accessibles donc DO sb > DO db

1 DO à 260 nm= 50 µg/ml d'ADN db ou 35 µg/ml d'ARN sb car ARN= plus instable


À retenir :

A retenir:

sondes nucléotidiques, random priming ou oligolabelling, nick translation, pcr, terminal transferase, polynucléotide kinase


Site utile:

http://acces.ens-lyon.fr/biotic/biomol/outilsbm/html/marqsond.htm#:~:text=Marquage%20par%20translation%20de%20coupure(Nick%20Translation)%20%3A&text=I%20pour%20d%C3%A9grader%20l'ADN,pr%C3%A9sence%20d'un%20nucl%C3%A9otide%20chaud.