I. DEFINITION ET CONTEXTE GENERALE

La réplication de l’ADN c’est la duplication du patrimoine génétique par synthèse ou polymérisation d’une nouvelle molécule d’ADN appelée molécule de novo. Cette étape est extrêmement importante car elle est nécessaire :

- à la survie de la cellule

- à la prolifération cellulaire

- à la prévention de l’apparition de mutations

• Ces mutations peuvent être délétères pour le fonctionnement cellulaire ou même pour le fonctionnement plus global d’un organe ou de l’organisme tout entier.

Cette étape de réplication de l’ADN, que ce soit au niveau procaryote ou eucaryote, précèdera la division cellulaire.

RAPPEL : La division ou multiplication cellulaire est le mécanisme qui vise à donner des cellules filles au patrimoine identique à partir d’une cellule mère. Ce mécanisme doit être le plus fidèle possible (car évènement cruciale ou peuvent se produire des erreurs), pour que le patrimoine génétique qui va être transmis aux cellules filles soit le plus parfaitement identique à celui de la mère. La survie à court termes de la cellule dépendra directement de la prévention des modifications de cet ADN.

Cette prévention va s’appuyer sur deux grands mécanismes :

- la fidélité de cette réplication assurée par différentes parades (donc pendant la réplication)

- la réparation de l’ADN (mécanismes post-réplicatifs) (cf cours réparation)

• La combinaison de ces deux groupes de mécanismes va permettre un taux de mutations des génomes qui va être extrêmement bas-> on estime 1 seul nucléotide modifié pour 10^9 nucléotides à chaque cycle de réplication = dans le cas du génome humain on estime donc 3 nucléotides modifiés à chaque réplication (car la taille du génome humain est de 3Gb)

La grande parade qui prévient ces mutations est l’utilisation de l’ADN mère comme matrice, ce mécanisme revient finalement à la copie d’un des deux brins de l’ADN mère.

Chacun des brins va servir à la synthèse de son propre brin fils.

La fidélité de la réplication est assurée par la complémentarité des bases comme décrites par Watson et Crick et tout ceci en maintenant une précision et une vitesse de réplications assez importantes.

- Exemple : la Réplication de l’ADN d’une cellule humaine est équivalent au recopiage de 1000 livres de 900 pages en 8h, en ne contenant que quelques fautes.

Pour comprendre comment ces trois modèles de réplication ont été séparés, des bactéries ont été mises en culture dans de l’azote 15 (lourd), qui permet après ultracentrifugation de retrouver une couche de bactéries qui migrent très loin au fond du tube. Mais lorsque l’on transfère cette croissance bactérienne dans un milieu cette fois-ci contenant de l’azote 14 (léger), on retrouvait ce mécanisme semi-conservatif avec une pelote mixte, plus lourde, et une pelote contenant de l’ADN plutôt léger qui correspond à celui répliqué dans l’azote 14. R

• La réplication est donc bien SEMI-conservative -> lors du premier cycle de réplication chaque brin d’ADN parental est associé à un brin d’ADN fils : c’est donc la molécule d’ADN qui sert de matrice et qui va permettre la synthèse d’un nouveau brin.

II. LES ACTEURS DE LA REPLICATION

II.A. LES ELEMENTS UTILISES

• L’ADN parental, qui va servir de matrice à la synthèse du brin fils dans le but d’éviter toutes modifications

• Les dNTPs : désoxyribonucléotides triphosphates (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) - Rentrent dans la réaction sous forme triphosphate

- L’hydrolyse de la liaison phosphate-phosphate va libérer l’énergie nécessaire à l’élongation des molécules d’ADN lors de la synthèse du brins fils

• Les ions Mg2+ - Stabilisent les dNTPs en les protégeant d’une hydrolyse enzymatique - Très important dans les applications médicales

II.B. LES ENZYMES

• L’hélicase :

- Grosse protéine qui a un rôle crucial dans la réplication de l’ADN

- Structure macromoléculaire avec plusieurs sous unités

- Supprime les liaisons hydrogènes entre les bases qui se font face -> permet la séparation des brins d’ADN, pours passer d’une structure double brins à une structure simple brin

- Consommation de beaucoup d’ATP pour apporter l’énergie nécessaire au déplacement de l’hélicase le long de l’ADN parental

- Après le passage de l’hélicase, liaison de protéine SSB (spécifique aux procaryotes) pour éviter la restauration spontanée de l’ADN (= que les 2 brins se ré-associent)

- Son passage va induire des surenroulements positifs (analogie du fil de téléphone enroulé) qui seront corrigées par les topoisomérases

• Les topoisomérases

- Ces enzymes vont modifier l’état d’enroulement de l’ADN pour induire ou supprimer des surenroulements positifs

- Dans le cas du passage de l’hélicase, elles vont supprimer des surenroulements positifs (= induire des surenroulements négatifs)

Plusieurs étapes d’action de la topoisomérase :

1) Coupure transitoire de l’ADN (simple ou double brin)

2) Libre rotation de l’ADN

3) Ressoudure des 2 brins de l’ADN

Il existe 2 classes de topoisomérases :

- Les topoisomérases I : n’agissent que sur un seul brin de l’ADN

- Les topoisomérases II : agissent sur les deux brins d’ADN.

Chez les procaryotes, la gyrase bactérienne est un exemple de topoisomérase II très importante

➢ La gyrase bactérienne est la cible d’une classe d’antibiotique, les quinolones, qui sont très utilisés en thérapeutique humaine puisqu’ils vont bloquer ces gyrases bactériennes pour bloquer la réplication bactérienne et ainsi stopper le développement bactérien.

• ADN polymérases

- Elles permettent la synthèse du brin fils par polymérisation un utilisant un brin d’ADN parental comme matrice.

- Différentes chez les eucaryotes et les procaryotes mais possèdent des caractéristiques communes

- Synthèse d’ADN toujours dans le sens 5’ -> 3’ en lisant le brin d’ADN matrice dans le sens 3’ -> 5’

- Ces ADN polymérases nécessitent une amorce d’ARN pour commencer à synthétiser, car elles ont besoin de commencer à une extrémité 3’OH libre.

- Cette amorce d’ARN sera quant à elle synthétisée par une ARN polymérase, nommée primase.

La polymérase est l’enzyme centrale de la réplication, et qui par plusieurs mécanismes, est la première garante de la fidélité de la réplication.

Il existe plusieurs mécanismes qui peuvent prévenir d’un nucléotide non complémentaire au nucléotide du brin matrice (erreur) :

- Mécanismes de vérification AVANT addition covalente du nucléotide : lorsque le dNTP entrant (= dNTP candidat) arrive, il va y avoir un changement de conformation de la polymérase pour vérifier si le nucléotide qui doit être inséré est le bon nucléotide complémentaire. Si cette transconformation montre que le nucléotide n’est pas le bon, il pourra donc être éliminé et ainsi éviter une erreur d’appariement.

- Mécanisme de vérification APRES addition covalente du nucléotide : cette activité de correction ou activité d’édition, est ce qu’on appelle une activité exonucléasique : la polymérase va pouvoir enlever les derniers nucléotides qu’elle a insérés. Cette activité se fait dans le sens 3’ -> 5’. Si le nucléotide inséré n’est pas complémentaire à celui du brin matrice, il va y a voir un mésappariement qui va empêcher l’ADN polymérase d’avancer, ce qui va lui permettre de couper ce dernier nucléotide et de reprendre la synthèse du brin fils une position en avant.

• La primase

- Enzyme ARN polymérase ADN dépendante qui va synthétiser les amorces d’ARN.

- Va permettre de donner l’extrémité 3’OH libre nécessaire à la polymérisation de la molécule d’ADN fille par l’ADN polymérase.

- /!\ Qu’elle soit procaryote ou eucaryote, l’ADN polymérase nécessite une amorce d’ARN pour synthétiser le brin fils /!\

- La primase elle, peut travailler à partir d’aucune amorce (= de novo) pour synthétiser quelques nucléotides par complémentarité avec le brin d’ADN matrice

- Une fois ces quelques nucléotides synthétisés, elle va se laisser détacher pour laisser place à l’ADN polymérase sur l’extrémité 3’OH libre.

- Les caractéristiques de l’amorce d’ADN, notamment sa taille, diffèrent chez les procaryotes et chez les eucaryotes.

III. MECANISME DE LA REPLICATION PROCARYOTE

III.A. L’INITIATION DE LA REPLICATION

1. Reconnaissance de l’origine de la réplication

❖ Chez le procaryote, la molécule d’ADN est circulaire

- Chromosome circulaire unique

- Apporte des contraintes stériques et de terminaisons différentes

- Génome généralement de plus petite taille, donc la quantité d’informations à recopier est plus courte

❖ Une seule origine de réplication : OriC

- C’est à partir de cette unique origine de réplication qu’on va trouver l’ouverture de la molécule de l’ADN par l’hélicase

- Cette origine de réplication contient une séquence consensus qui fait environ 245 pb et qui va permettre la fixation de l’hélicase et donc l’ouverture de la molécule d’ADN

❖ Réplication bidirectionnelle -

- L’ADN polymérase va se propager dans les deux sens par rapport à l’origine de réplication

❖ Réplication rapide

- On parle d’environ 1 kb/s

- Pour le chromosome bactérien complet, en fonction des espèces de bactéries, il faut compter entre 20 à 100 minutes répliquer la totalité du chromosome bactérien (24/48H chez l’homme)

❖ Une seule séquence de terminaison

2. Le primosome

L’initiation de la réplication procaryote va faire intervenir un complexe qu’on appelle le primosome. Ce primosome va faire intervenir les acteurs essentiels à l’initiation de la réplication.

- Il correspond à l’association d’une hélicase et d’une primase

- L’hélicase coupe la molécule d’ADN

- La primase qui commence à synthétiser l’amorce d’ARN

Ces deux enzymes vont interagir pour former ce complexe, et vont ainsi permettre le recrutement des protéines fixatrices qui stabilisent la molécule d’ADN simple brin et éviter que les liaisons hydrogènes ne se reforment entre les bases complémentaires.

- Pour les procaryotes, il s’agit des protéines SSB

Ensuite l’hélicase va continuer sa progression le long de la molécule d’ADN, et on va observer l’intervention de topoisomérase I (un seul des deux brins) qui vont permettre d’enlever les surenroulements positifs induits par le déplacement de l’hélicase.

3. Synthèse de l’amorce et fixation de l’ADN polymérase

L’amorce d’ARN est très courte chez les procaryotes :

- Elle peut mesurer de 4 à 12 nucléotides

- Elle est synthétisée dans le sens 5’ -> 3’ car la primase ne fait pas exception elle synthétise dans le même sens que les autres polymérases

- Cette amorce sera également complémentaire au brin d’ADN parental.

III.B. L’ELONGATION

1. Caractéristiques des ADN polymérases procaryotes

Une fois l’initiation terminée, c’est-à-dire une fois que la molécule d’ADN a été ouverte et que l’amorce d’ARN a été synthétisée, vont pouvoir intervenir les ADN polymérases.

Il existe 3 ADN polymérases procaryotes, qui possèdent des structures mais surtout des rôles différents.

- L’ADN polymérase III est l’ADN polymérase principale de la réplication procaryote. Elle a une activité de polymérisation 5’ -> 3’ et une activité exonucléasique 3’ -> 5’ comme vu auparavant.

On retrouve la vitesse de polymérisation d’environ 1kb/s.

- L’ADN polymérase II qui est impliqué dans la réparation post-réplicative de l’ADN

- L’ADN polymérase I qui est impliqué dans la terminaison de la réplication de l’ADN puisqu’elle possède une activité exonucléasique 5’ -> 3’ supplémentaire

L’ADN polymérases III est donc principalement en charge de la réplication procaryote, mais elle va être assistée des deux autre ADN polymérases beaucoup plus lentes, mais réservées à des étapes spécifiques de la réplication.

2. La réplication des deux brins d’ADN parentaux

On observe une fourche de réplication qui correspond à l’ouverture de de la molécule d’ADN, et cette fourche de réplication va donc se déplacer vers la gauche et vers la droite.

Comme les polymérases ne peuvent synthétiser que dans le sens 5’ -> 3’, on va avoir une polymérisation différente sur chaque brin :

- Sur le brin dans le sens 5’ -> 3’ de l’ouverture de l’ADN, il n’y aura qu’une seule initiation (une seule synthèse d’amorce) et donc la polymérase va pouvoir synthétiser la totalité du brin fils de façon continue dans le sens de l’ouverture de la fourche.

- Sur le brin qui est lui dans le sens 3’ -> 5’, la polymérase ne peut synthétiser la molécule d’ADN fille de façon continue. Il est nécessaire d’attendre l’ouverture de l’ADN afin de pouvoir faire plusieurs amorces d’ARN et donc de revenir dans le sens 5’ -> 3’.

La synthèse de ce brin sera donc discontinue.

➢ On a donc une synthèse continue sur le brin « avancé » et une synthèse discontinue sur le brin « retardé ».

Les différents fragments du brin d’ADN fils retardé composé d’une amorce d’ARN et de nucléotides polymérisés par l’ADN polymérase se nomme les fragments d’Okazaki.

➢ Chez les procaryotes, les fragments d’Okazaki sont relativement longs puisqu’ils sont composés de 1000 à 2000 nucléotides et ont la particularité d’être composés d’ADN et d’ARN puisqu’ils contiennent les amorces d’ARN.

Lorsque seront enlevés les amorces d’ARN on ne parlera plus de fragments d’Okazaki car les amorces seront remplacées par de l’ADN et le tout sera lié en continuité afin de former le brin fils.

3. Maintien de l’ADN polymérase III

L’ADN polymérase principal de la réplication procaryote va être maintenu autour de brin d’ADN parental par un clamp ou « collier coulissant » qui va permettre de fixer l’ADN polymérase afin d’éviter son décrochage car ce n’est pas une structure stable qui de plus est en perpétuel mouvement.

Ce clamp est en réalité la sous-unité β du complexe holoenzyme ADN pol III. C’est en réalité ce clamp qui permet d’atteindre une vitesse de réplication élevée d’environ 1kb/s chez le procaryote. La fixation du clamp est régie par une protéine qui va permettre de charger le clamp, c’est une étape dite ATP-dépendante car sa fixation à l’arrière de l’ADN polymérase va nécessiter de l’énergie.

III.C. LA TERMINAISON

1. Finition des brins fils

La terminaison va encore une fois se faire de façon différente sur le brin d’ADN retardé et sur le brin d’ADN avancé :

- Sur le brin d’ADN retardé, la molécule fille est dans un premier temps constitué de différents fragments d’Okazaki composés d’amorce d’ARN et d’une séquence d’ADN. Il va donc falloir éliminer les fragments d’ARN présents, et pour se faire on va faire appel à l’ADN polymérase I et non pas III, qui elle va pouvoir allonger le fragment d’ADN qui se trouve en arrière par son activité polymérase 5’-> 3’.

Mais elle va également pouvoir enlever l’amorce d’ARN qui se trouve devant elle grâce à son activité exonucléasique 5’-> 3’.

Le fait qu’elle associe l’hydrolyse de l’amorce d’ARN et la synthèse d’ADN pour remplacer cette amorce, explique qu’elle est une vitesse de progression bien plus faible que l’ADN polymérase III.

Après le passage de l’ADN polymérase I il n’y aura plus que de l’ADN, mais les fragments ne seront toujours pas liés les uns aux autres. Une ADN ligase va donc rentrer en jeu pour créer les liaisons phosphodiesters manquantes pour obtenir cette fois-ci une molécule d’ADN continue.

2. Séparation des brins et méthylation

• La dernière étape de la réplication est la séparation des brins, car après réplication, si on n’a pas cette dernière étape de séparation, les deux brins vont être liés les uns aux autres.

Cette séparation aura lieu grâce à la gyrase bactérienne qui est une topoisomérase II puisqu’elle va couper les deux brins et va permettre leur séparation afin d’obtenir deux molécules d’ADN différentes.

• On observe encore une autre étape, mais celle-ci est en réalité post-réplicative: c’est la méthylation des brins néosynthétisés. Cette méthylation correspond à l’ajout d’un groupement méthyl (CH3) sur les cytosines ou les adénines du brin fils par une enzyme qui s’appelle la méthylase.

Cette méthylation se fait sur des cytosines et des adénines particulières qui sont inclues dans des séquences palindromiques, et ne se fait uniquement si le brin parental est également méthylé en cette position.

Cette méthylation va se faire avec une latence par rapport à la polymérisation, c’est-à-dire que pendant un instant, le brin fils ne sera pas méthylé, alors que le brin matrice le sera. Donc on peut différencier à l’issue de la réplication le brin parental du brin fils, étape qui est très importante pour la réparation.

➢ Il y a donc deux éléments qui doivent être identiques entre le brin parental et le brin fils : la séquence des nucléotides et leur méthylation.

❖ Chez les bactéries, la méthylation permet de les protéger contre les virus. Chez l’homme, cette méthylation permet de réguler les gènes. En effet, elle a pris l’exemple du gène de l’insuline qui n’est exprimé qu’au niveau des cellules beta du pancréas. Ainsi, le gène est « éteint » dans les autres endroits du corps (comme dans le cerveau par exemple) en méthylant les bases au niveau de ce gène.

IV. MECANISMES DE LA REPLICATION EUCARYOTE

IV.A. LES SPECIFICITES PAR RAPPORT AUX PROCARYOTES

• Le génome eucaryote est foncièrement différent du génome procaryote :

- Molécule d’ADN linéaire

- Molécule d’ADN qui n’est pas unique puisqu’on a une organisation en chromosomes

- Chaque chromosome est composé d’une molécule d’ADN unique qui est en plus associée à des protéines nommées histones, qui vont permettre une organisation en chromatine avec plusieurs différences de condensation.

• Vitesse de réplication eucaryote largement inférieure à celle de la réplication procaryote -> 50 nucléotides par seconde environ

• Plusieurs origines de réplication (OR) pour palier à cette vitesse plus faible

- On compte de 20 à 100 000 OR par cellule, en fonction de leur capacité réplicative

- Présence d’unités de réplication, qui correspondent à l’activation d’un groupe de 20 à 80 OR pour avoir la réplication d’une région du génome la plus synchrone possible

IV.B. NOTION DE CYCLE CELLULAIRE

La notion de cycle cellulaire est une notion qui n’est pas présente dans la réplication procaryote.

Or ici, la réplication eucaryote va se produire pendant la phase S du cycle cellulaire.

RAPPEL : Le cycle cellulaire est composé :

- D’une phase M = Mitose qui correspond à la division cellulaire en elle-même

- De la phase S, qui correspond à la réplication de l’ADN

- De phases interphasiques : G1, G2 et G0 qui sont des étapes importantes du cycle cellulaire

• Il y a également une différence de temporalité chez l’eucaryote qui complexifie la réplication, car il y a une différence de condensation de la chromatine en fonction de l’activité transcriptionnelle en fonction des régions du génome :

- L’hétérochromatine qui est fortement condensée et qui possède une activité transcriptionnelle assez faible, qui va se répliquer de façon tardive grâce à une activation tardive des OR

- L’euchromatine qui est moins condensée, plutôt relâchée, on aura une activation précoce des origines de réplication qui va permettre sa réplication précoce.

IV.C. LES ACTEURS EUCARYOTES

1. Point de vue général

• L’ADN parental va toujours servir de matrice, pour la synthèse du brin fils.

• Les dNTPs sont toujours nécessaires à la réplication, et sont les mêmes que ceux utilisés pour la réplication procaryote. Par le même fonctionnement d’hydrolyse de la liaison phosphodiester, ils apportent l’énergie nécessaire à l’élongation du brin néosynthétisé.

• Le magnésium est toujours utilisé pour stabiliser et protéger ces dNTPs

• L’hélicase est utilisée de la même façon, et nécessite toujours la consommation d’ATP en quantité importante. En revanche les protéines stabilisatrices de la molécule d’ADN simple brin après le passage de l’hélicase pour éviter la reformation des liaisons hydrogènes entre les nucléotides, ne sont PAS les protéines SSB mais les protéines RPA.

• On a toujours besoin de topoisomérases, de type I qui ne coupent l’ADN que sur un seul brin, et de type II qui coupe les deux brins, pour éliminer les surenroulements.

• Toujours besoin d’ADN polymérase, qui sont en nombre plus important et qui ont des fonctions plus importantes également.

• La primase est également nécessaire, car là encore, les ADN polymérases ne sont pas capable de travailler à partir de rien.

2. Les ADN polymérases eucaryotes

On a trois principales ADN polymérases eucaryotes :

1 – l’ADN polymérase δ : c’est l’équivalent de l’ADN polymérase III procaryote, l’enzyme principale de la réplication des deux brins de la molécule d’ADN, le brin retardé et le brin avancé. Elle va faire la réplication totale du brin avancé toujours dans le sens 5’-3’ car on a besoin que d’une seule amorce d’ARN pour la réplication de ce brin. En revanche elle va faire la réplication partielle du brin retardé, mais elle va aussi permettre la finition des brins.

Elle possède la même activité d’édition que l’ADN polymérase III (exonucléasique) dans le sens 3’-5’.

Le clamp s’appelle cette fois la protéine PCNA, protéine très importante car il existe des variations pathogènes sur ce gène qui entraînent des conséquences assez graves, mais ce clamp à la même fonction que chez les procaryotes : maintenir l’ADN polymérase le long du brin d’ADN parental.

2– l’ADN polymérase α : elle va initier la réplication sur le brin retardé, qui sera par la suite récupérée par l’ADN polymérase delta.

3 – l’ADN polymérase ϒ : elle est en charge de la réplication de l’ADN mitochondrial, car l’ADN eucaryote complet est composé de l’ADN mitochondrial + ADN nucléaire.

Il existe beaucoup plus d’ADN polymérase eucaryotes qui ont des rôles variés, et qui ont quelques correspondances avec les ADN polymérases procaryotes.

Toutes ces ADN polymérases sont codées par des gènes différents et ont des localisations préférentiellement nucléaires, à l’exception de l’ADN polymérase gamma qui est localisée dans la mitochondrie.

L’élimination des amorces d’ARN chez l’eucaryote est faite soit par la RNAse H, soit par l’exonucléase FEN1 qui vont permettre de libérer ces molécules d’ARN, et ces lacunes seront comblées par l’ADN polymérase delta, et comme chez le procaryote on observera l’action d’une ligase qui viendra établir une continuité sur le brin fils du brin retardé.

Les fragments d’Okazaki sont nettement plus courts chez les eucaryotes puisqu’ils mesurent entre 100 à 200 nucléotides. Les fragments d’Okazaki sont donc en plus grand nombre le long du brin d’ADN parental.

IV.D. LES NUCLEOSOMES

Les nucléosomes sont des particularités eucaryotes. La molécule d’ADN eucaryote va s’organiser autour de ces complexes multi-protéiques, ils vont permettre l’enroulement de la molécule d’ADN autour deux , qui peut être plutôt large ou plutôt resserré.

On connaît encore mal aujourd’hui ce qu’il se passe quant à la réplication au niveau de ces nucléosomes. Ce que l’on sait en revanche c’est que le nucléosome participe largement à la diminution de la vitesse de réplication eucaryote.

Il y a également une identité entre le brin fils et le brin parental grâce au positionnement des différents nucléosomes, qui va être identique grâce à la synthèse de novo de nouvelles protéines histones afin de condenser le brin fils.

IV.E. CAS PARTICULIER DES TELOMERES

Les télomères sont les extrémités des chromosomes. Au niveau de ces extrémités, nous allons retrouver des séquences répétées TTAGGG (séquence pas à connaître), qui sont répliquées un grand nombre de fois et qui sans le mécanisme de réplication dédié entraineraient un raccourcissement des chromosomes à chaque cycle de réplication, notamment sur le brin retardé à cause de la réplication discontinue.

Ce mécanisme permet d’éviter le raccourcissement des chromosomes et ainsi d’éviter de menacer l’intégrité cellulaire et l’intégrité des chromosomes, ce qui provoquerai la mort de la cellule.

C’est ce qu’il se passe lorsque l’on observe des cellules en culture, si on ne fait pas en sorte de promouvoir cette réplication des télomères, ils vont donc se raccourcir, les cellules ne vont plus se diviser, c’est ce qu’on appelle la sénescence réplicative.

Ces télomères vont être répliqués par une enzyme particulière que l’on va appeler télomérase. Cette télomérase est une protéine particulière que l’on appelle une ribonucléoprotéine puisqu’il s’agit d’une protéine qui contient également une matrice d’ARN.

La télomérase va donc polymériser de l’ADN grâce à sa matrice d’ARN interne, c’est donc une ADN polymérase ARN dépendante. Ces enzymes qui sont ADN polymérase ARN dépendante font ce qu’on appelle une rétrotranscription. Au niveau de l’extrémité du brin retardé, on va avoir cette séquence libre qui ne sera pas répliquée par le mécanisme standard. On va avoir fixation de la télomérase sur l’extrémité 3’OH libre du brin retardé et donc une réplication de ces séquences en tandem (TTAGGG) les unes à la suite des autres un bon nombre de fois. Nous allons donc avoir des séquences à répliquer de nouveau, de la même façon que la réplication eucaryote standard (primase, ADN polymérase, ligase), on aura donc répliqué le télomère.

Cependant, malgré l’activité de la télomérase, l’extrémité 3’ reste plus longue que l’extrémité 5’ avec une structure simple brin qui est présente sur quelques nucléotides, qui va provoquer une structure tridimensionnelle particulière nommée boucle-t. Elle aura pour rôle de protéger l’extrémité des chromosomes contre les enzymes de dégradation, qui risquerait de se faire dégrader si elle n’était pas protégée.

La longueur des télomères est régulée par les cellules et l’organisme, et c’est finalement un équilibre entre le raccourcissement à chaque division cellulaire, et l’activité de la télomérase. C’est cet équilibre là qui va déterminer la longueur de l’extrémité du chromosome.

En cas de vieillissement de la cellule traduit par une baisse de l’activité de la télomérase, on ne va plus avoir assez de réplication des télomères et donc les télomères vont raccourcir, c’est ce qu’on appelle la sénescence cellulaire (comme vu plus haut).

Ce mécanisme a rapidement été découvert, car lorsque l’on place des cellules normales (non cancéreuse) en culture in vitro, progressivement l’activité de la télomérase va diminuer, elle va devenir insuffisante pour contrebalancer le raccourcissement des télomères. Donc progressivement, on va une diminution de la réplication et donc une sénescence réplicative plutôt rapide.

Pour garder des cellules vivantes en culture in vitro, il faut passer par une cancérisation des cellules, cela s’appelle une immortalisation, car cela provoque l’activité de la télomérase pour finalement garder ces cellules en culture quasiment indéfiniment.

IV.F. LA METHYLATION

On observe le même mécanisme que chez les procaryotes, celui de la méthylation. Celle-ci a ici aussi un rôle dans la réparation de l’ADN mais également dans l’expression des gènes. Cependant cette fois-ci, la méthylation ne se fait que sur les cytosines. Ce sont les seules bases méthylables par une méthylase, et celle-ci sont inclut dans des séquences particulières riches en C et en G.

Encore une fois, la fixation d’un groupement méthyl se fera dans un souci d’identité entre le brin fils et le brin parental, car seuls les ilots CG méthylés sur le brin parental seront méthylés de façon post-réplicative sur le brin fils. Ainsi, les cytosines inclues dans des ilots CG mais qui ne sont pas complémentaire à des ilots CG méthylés, ne seront pas ciblés par la méthylase.

Comme chez les procaryotes, on observe un temps de latence pendant lequel on peut différencier le brin d’ADN parental du brin d’ADN fils, ce qui va servir lors de la réparation des mésappariements.

V. EXEMPLES D’APPLICATIONS MEDICALES

V.A. LA REPLICATION COMME CIBLE THERAPEUTIQUE

La connaissance de la réplication, mais surtout la connaissance des acteurs de la réplication forme une base intéressante pour être la cible thérapeutique de quelques.

- La bléomycine qui va endommager l’ADN et inhiber la réparation

- Certains nucléotides, comme le 5-fluorouracile, la cytosine arabosine, 6-mercaptopurine ou l’AZT qui sont des molécules avec des activités pouvant être très différentes : des anticancéreux, des médicaments contre le rejet de greffe... Ces nucléotides vont prendre la place des dNTPs naturels et vont donc empêcher la réplication

- Des molécules intercalantes qui vont se fixer sur l’ADN et ainsi bloquer la progression de l’ADN polymérases.

Ces molécules vont également avoir une utilité en biologie médicale, puisque les intercalants vont pouvoir rendre visible la molécule d’ADN en se fixant sur celle-ci, c’est notamment le cas de BET, agent très utilisé pour mettre en évidence la molécule d’ADN

V.B. LES ACTEURS DE LA REPLICATION COMME CAUSE DE CERTAINES MALADIES GENETIQUES

La connaissance fine des différents acteurs de la réplication nous permet d’intervenir dans cette réplication, et utiliser cette intervention à des fins médicales.

Il existe des variations pathogènes de certains gènes codant certains acteurs de la réplication :

- L’exemple du gène PCNA qui va coder le clamp. L’article suivant montre que la guanine a anormalement été remplacé par une thymine. Cette variation est à l’origine d’un syndrome neurologique nommé Ataxia telangiectasia.

- La télomérase peut également être la cible de variations pathogènes, comme on touche à la réplication, il s’agit souvent de maladies syndromique ou cancéreuse. Ici il est décrit différentes variations au niveau du promoteur du gène TERT qui code la télomérase. Les mutations au niveau du promoteur vont entraîner une diminution de l’expression de la télomérase, qui va elle -même être associé à différentes tumeurs.

V.C. UTILISATION DES POLYMERASES EN BIOLOGIE MEDICALE

L’utilisation des polymérases, notamment procaryotes, sont la base de l’utilisation de la PCR (polymerase chain reaction). Ces PCR sont également la base d’à peu près toutes les applications utilisant l’ADN.

Tout le génie génétique passe au moins une fois par une étape de PCR. Cette PCR va permettre grâce à des variations de température successive, sous forme de cycles, et grâce à une ADN polymérase qui a depuis quelques années la capacité d’être thermostable (résiste à toutes les variations de température), va permettre de recopier une séquence particulière, finalement de l’enrichir, afin de la rendre étudiable.

Sans la connaissance des ADN polymérases, on n’aurait pas la possibilité d’effectuer cette PCR, pourtant tant utilisée en biologie médicale.

VI. CONCLUSION

• La duplication du patrimoine génétique c’est la base de toute physiologie cellulaire, car elle permet la réplication et donc elle permet de donner deux cellules filles les plus identiques possibles

• C’est pourquoi la réplication se doit d’être fidèle

• On a donc trois mécanismes qui vont participer à cette fidélité :

- La polymérisation en utilisant l’ADN parental comme matrice

- La correction exonucléasique qui permet encore de diminuer le taux d’erreur

- Correction des mésappariements qui va encore faire baisser le taux d’erreurs lors de la réplication