La qPCR, ou PCR quantitative en temps réel, est une méthode qui permet de mesurer la quantité d'ADN pendant son amplification. Contrairement à la PCR classique, elle ne se contente pas de dire si l'ADN est présent, mais combien il y en a au départ.
qPCR (PCR quantitative en temps réel)
Technique de laboratoire qui mesure la quantité d'ADN cible au fur et à mesure de son amplification.
Fluorescence
Émission de lumière par une substance (comme un colorant) après qu'elle ait absorbé de l'énergie lumineuse.
Ct (Cycle threshold ou Cycle de seuil)
Le numéro du cycle de PCR où le signal fluorescent de l'ADN amplifié devient détectable et dépasse le bruit de fond.
SYBR Green
Un colorant fluorescent qui se lie spécifiquement à l'ADN double brin et émet de la lumière.
Balise moléculaire (Molecular Beacon)
Une petite sonde d'ADN fluorescente qui change de forme et émet de la lumière lorsqu'elle se fixe à une séquence d'ADN cible.
1. Qu'est-ce que la qPCR ? 
La qPCR est une version avancée de la PCR (Réaction en Chaîne par Polymérase). Son but est de copier une séquence d'ADN spécifique, mais aussi de mesurer la quantité de cet ADN au fur et à mesure de la réaction. On dit « en temps réel » car la mesure est faite à chaque étape du processus. Cela permet de savoir combien d'ADN était présent au début de la réaction.
2. La cinétique de la qPCR et le Ct 
Pendant la qPCR, la quantité d'ADN augmente. Au début, l'augmentation est lente (phase d'initiation), puis elle devient très rapide (phase exponentielle), et enfin elle ralentit (phase plateau). Pour suivre cette augmentation, on utilise un signal fluorescent. Ce signal est mesuré à chaque cycle de PCR. Le Ct (Cycle de seuil) est le moment précis où le signal fluorescent dépasse un niveau de base (le seuil). Plus il y a d'ADN au départ dans l'échantillon, plus vite le signal atteint le seuil, et donc plus le Ct est bas.
3. Comment détecter l'ADN en qPCR ? La fluorescence ! 
Pour mesurer l'ADN en temps réel, la qPCR utilise des molécules qui émettent de la lumière (fluorescence) quand elles se lient à l'ADN amplifié. Il existe deux grandes familles de ces molécules :
A. Les colorants qui se lient à l'ADN double brin (comme le SYBR Green)
Le SYBR Green est un colorant qui, seul dans la solution, émet très peu de lumière. Mais quand il se fixe à l'ADN double brin qui est fabriqué pendant la PCR, il se met à briller intensément. Plus il y a de copies d'ADN, plus il y a de SYBR Green lié, et plus le signal lumineux est fort. C'est une méthode simple, mais le SYBR Green peut se fixer à n'importe quel ADN double brin, même s'il n'est pas celui que l'on veut amplifier.
Le SYBR Green est un colorant qui, seul dans la solution, émet très peu de lumière. Mais quand il se fixe à l'ADN double brin qui est fabriqué pendant la PCR, il se met à briller intensément. Plus il y a de copies d'ADN, plus il y a de SYBR Green lié, et plus le signal lumineux est fort. C'est une méthode simple, mais le SYBR Green peut se fixer à n'importe quel ADN double brin, même s'il n'est pas celui que l'on veut amplifier.
B. Les sondes fluorescentes (comme les balises moléculaires)
Les balises moléculaires sont des petites molécules d'ADN conçues pour se fixer à une séquence très spécifique. Elles ont une forme d'épingle à cheveux. Quand elles sont repliées, une partie qui émet de la lumière (le fluorochrome) est très proche d'une autre partie qui bloque cette lumière (l'extincteur). Il n'y a donc pas de fluorescence. Mais quand la balise rencontre sa séquence d'ADN cible, elle s'ouvre et s'y fixe. Le fluorochrome et l'extincteur s'éloignent l'un de l'autre, et la balise se met à émettre de la lumière. Cette méthode est plus spécifique car la sonde ne brille que si elle reconnaît la bonne séquence d'ADN.
Les balises moléculaires sont des petites molécules d'ADN conçues pour se fixer à une séquence très spécifique. Elles ont une forme d'épingle à cheveux. Quand elles sont repliées, une partie qui émet de la lumière (le fluorochrome) est très proche d'une autre partie qui bloque cette lumière (l'extincteur). Il n'y a donc pas de fluorescence. Mais quand la balise rencontre sa séquence d'ADN cible, elle s'ouvre et s'y fixe. Le fluorochrome et l'extincteur s'éloignent l'un de l'autre, et la balise se met à émettre de la lumière. Cette méthode est plus spécifique car la sonde ne brille que si elle reconnaît la bonne séquence d'ADN.
4. Quantifier l'ADN : Absolue ou Relative ? 
Une fois que l'on a les valeurs de Ct, on peut calculer la quantité d'ADN initiale de deux manières :
A. Quantification Absolue
Cette méthode permet de connaître la quantité exacte d'ADN cible dans un échantillon. Pour cela, on prépare une série d'échantillons avec des quantités d'ADN connues (une « courbe standard »). On mesure leur Ct. Ensuite, on compare le Ct de notre échantillon inconnu à cette courbe standard pour trouver sa quantité d'ADN précise. Plus le Ct est bas, plus la quantité d'ADN initiale est élevée.
Cette méthode permet de connaître la quantité exacte d'ADN cible dans un échantillon. Pour cela, on prépare une série d'échantillons avec des quantités d'ADN connues (une « courbe standard »). On mesure leur Ct. Ensuite, on compare le Ct de notre échantillon inconnu à cette courbe standard pour trouver sa quantité d'ADN précise. Plus le Ct est bas, plus la quantité d'ADN initiale est élevée.
B. Quantification Relative
Cette méthode ne donne pas une quantité exacte, mais compare la quantité d'ADN cible entre différents échantillons. Par exemple, on peut comparer l'expression d'un gène dans un échantillon traité par rapport à un échantillon non traité. Pour cela, on utilise un « gène de référence » (ou contrôle endogène) dont la quantité ne change pas. On utilise aussi un « calibrateur », qui est un échantillon de base (par exemple, l'échantillon non traité). On calcule des différences de Ct pour voir si la quantité d'ADN cible a augmenté ou diminué par rapport au calibrateur, en tenant compte du gène de référence.
Cette méthode ne donne pas une quantité exacte, mais compare la quantité d'ADN cible entre différents échantillons. Par exemple, on peut comparer l'expression d'un gène dans un échantillon traité par rapport à un échantillon non traité. Pour cela, on utilise un « gène de référence » (ou contrôle endogène) dont la quantité ne change pas. On utilise aussi un « calibrateur », qui est un échantillon de base (par exemple, l'échantillon non traité). On calcule des différences de Ct pour voir si la quantité d'ADN cible a augmenté ou diminué par rapport au calibrateur, en tenant compte du gène de référence.
A retenir :
- La qPCR mesure la quantité d'ADN amplifié en temps réel grâce à un signal fluorescent.
- Le Ct (Cycle de seuil) est le nombre de cycles où la fluorescence dépasse un seuil ; il est inversement lié à la quantité d'ADN initiale.
- Deux types de détection fluorescente existent : les colorants (comme le SYBR Green) qui se lient à tout ADN double brin, et les sondes spécifiques (comme les balises moléculaires) qui brillent en se fixant à une séquence précise.
- La quantification absolue donne la quantité exacte d'ADN en utilisant une courbe standard.
- La quantification relative compare les quantités d'ADN entre échantillons, souvent avec un gène de référence et un calibrateur, pour voir des changements d'expression.