Exemple de banques d'ADN
Protocole:
- Préparer un vecteur (utilisation de deux ER différentes)
- Préparer l'insert
- Utiliser la phosphatase alcaline (déphosphoriler le 5'P)
- Mettre en contact le fragment d'intérêt x et le vecteur
- Ajouter la ligase
- Préparer les cellules hôtes en les rendant compétentes
- Faire pénétrer le vecteur recombinant dans la cellule
- Etaler sur boîte, les cultiver, les sélectionner etc etc
Banque génomique:
- Contient des fragments de l'ADN d'un organisme obtenus par sonication ou digestion partielle par ER
- L'ensemble des fragments représente l'ensemble du génome
Banque d'ADNc:
- Contient l'ensemble des ARNm d'une cellule ou d'un tissu, sous forme de copies d'ADN
- Au moins une copie de chaque ARNm de la cellule ou du tissu
- Spécifique d'une lignée cellulaire ou d'un tissu donné, à un moment et état physiologique donnés
Obtention de l'ADN à partir d'ADNc:
- Utilisation de l'oligodT pour l'hybridation avec la queue poly A
- Rétrotranscription grâce à une transcriptase inverse + 4 dNTP
- Synthèse de l'ADNc
- Ajout de la RNase H (dégradation de l'ARN sb)
- Ajout d'une ADN polymérase + 4 dNTP (polymérisation à partir de certaines hybridations)
- Ajout de nucléase S1 et obtention d'un ADN db