Méthode de Sanger

Méthode originelle de Sanger:

Détermination de l'ordre des quatre nucléotides dans un brin d'ADN.

Cette ordre permet aux cellules de savoir comment se comporter.

Il se base sur le procédé de la réplication de l'ADN.

Se réalise en quatre réaction pour chaque nucléotide, ou chaqu'un aura un colorant différent qu'on observera sous rayon UV.

On réalise à la fin une électrophorèse sur gel, qui permet de séparer les fragments d'ADN. Cela nous permettra de lire les bandes sur chaque colonne attribué à un nucléotides.

Automatisation : le séquençage cyclique fluorescent capillaire automatisé

• Séquençage cyclique:

Utilisation d'ADN polymérases thermostables et fidèles.

En thermocycleur, cycles, mais différent de PCR : une seule amorce.

• Automate capillaire:

Migration dans un fin capillaire contenant un polymère = pseudo polyacrylamide dénaturant.

pas de gel à couler ni de dépôt à effectuer.

migration plus rapide ("run" en 2h).

multicanaux (96).

• Marquage fluorescent:

4 ddNTP marqués avec 4 fluorochromes différents = 1 seul tube de MR.

Chaque fluorochrome possède une longueur d'onde d'émission différente, traduisible par une couleur.

>Big Dye Terminator version 2:

La technologie BDT utilise un système de transfert d’énergie par résonance (FRET) entre deux fluorochromes fixés sur le même ddNTP et reliés entre eux par un linker.

Fluorescéine est excité par un rayon laser, son énergie est captée par Dichlororhodamine (qui est différent pour chaque type de ddNTP) qui est excité a son tour.

Le spectre de la fluorescence réémise sera ainsi spécifique de chaque type de ddNTP.

Le séquençages des génomes:

• Stratégie de séquençage aléatoire:

-Fragmentation aléatoire de l'ADN : enzymatique (DNase) pu mécanique (sonication).

-Séquençages au hasard des extrémités des petits fragments.

-Assemblage informatique des séquences chevauchantes en contigs.

• Stratégie ordonnée ou « clone par clone » ou « shotgun hiérarchique »:

-Stratégie adoptée par le consortium international pour le séquençage du génome humain.

-Établissement d’une carte génétique puis d’une carte physique.

-Obtention d'une banque ordonnée de grands fragments.

• Finition Comblement des trous par PCR combinatoire

Le pyroséquençage:

Milieu réactionnel: amplicon dénaturé + amorce de séquençage + ADN polymérase + enzymes et substrats de révélation de l'incorporation.

Les nucléotides sont ajoutés l'un après l'autre au milieu réactionnel.

Si le nucléotide ajouté est incorporé dans le brin en cours de synthèse, il y a libération d'un PyroPhosphate qui conduit par une cascade de réactions enzymatiques à une émission de lumière.