I.1)Histoire

*1665:début de la biologie cellulaire, Robert Hook

*Antoni von Leeuwenhoek, Hollande => association de 2 lentilles -> grossissement de x50 à 300

*1674:découverte de protistes(gouttes d'eau dans un étang)

*1683:première observation de bactérie

*1838=> les plantes sont plus ou moins constitué de cellule différentes et l'embryon végétal provient d'une seule cellule.

*1939:Théodor Schwann: structure semblable pour cellule végétal et animales

II)microscope en biologie cellulaire:

*examiner des objets trop petit à l'œil nu

*invention: XVIIe siècle => repose sur l'utilisation de lentilles

*outil principale de nombreuses disciplines => microbiologie, cytologie, histologie

*électronique et information => nouvelle génération, plus performant.

1)microscope photonique:

microscope photonique=optique (différent de l'électronique) => utilise de la lumière de longueur d'onde du visible et parfois dans l'UV

*dans un microscope il y a:

-une lumière

-des objets traversée

-objectif-> agrandi et inverse

-oculaire-> agrandi

b)limite de séparation, pouvoir séparateur et résolution

lumière de nature oculaire

-limite de résolution microscopique photonique: lumière visible 0,4 à 0,7 ?m

-bactérie mitochondrie=500 nm=0,5 ?m

-Si l’objet est trop petit il peut y avoir des déphasage

-limite de séparation d’un microscope : c’est l’écart minimale entre 2 points objets qui est nécessaire pour distinguer avec le microscope

?en dessous de cette valeur, les 2 points apparaissent alors comme un seul point lorsqu’on les observe au microscope.

-pouvoir séparateur d’un microscope (=résolution)= c’est l’efficacité séparatrice du microscope, dépend de la limite de séparation.

? plus la limite de séparation d est faible, plus le microscope est performant.

Comment diminuer d ?

-diminuer la longueur d’onde (pas facile)

-augmenter l’ouverture numérique de l’objectif (n sin a)

-augmenter n qui passe de 1 dans l’air à 1,52 dans l’huile à immersion

-augmenter a en utilisant des objectifs qu’on pourra approcher très près de la propagation.

c)profondeur de champ

nécessite de faire varier la mise au point pour parcourir toute l’épaisseur de l’échantillon

elle varie suivant les objectifs: elle est d’environ 25 ?m à l’objectif 10 et 1 ?m seulement à l’objectif

100 à immersion.

B) techniques de préparation histologiques et cytologiques

-observation directe de cellules vivante=observation vitale (difficile)

-le plus souvent prélèvement des tissus : 2 cas

a) observation supra-vitale :

les cellules vivante sont prélevées et plongées dans du liquide physiologiques pour la survie :

? eau salée,sucrée ou liquide de Ringer qui contient des sels minéraux

Si coloration : uniquement avec des colorants vitaux (gardent les cellules en vie)

b) observation post-vitales :

*la fixation :

-stabilise les cellules dans l’état dans lequel elles se trouvaient au moment de leur prélèvement et les rend perméables aux colorants

-fixateurs=alcools, aldéhydes ,acides, etc.

-durée de fixation dépend de la taille et de la nature de l’échantillon à fixer.

*la déshydratation :

nécessaire pour pouvoir inclure l’échantillon dans un support hydrophobe pour le couper

-élimination de l’eau: bains d’alcool de degrés croissant, dernier bain de toluène (sert à éliminer l’alcool à 100°C)

*L’inclusion :

inclusion des échantillons (mou et fragiles après fixation)avant de les couper.

Utilisation de cires, résine(paraffine, époxy) ? chauffer ? sous liquide +échantillon

étuve? imprègnent le tissu fixé ? refroidissement solidification

*coupe au microtome :

microtome: instrument permettant d’effectuer des coupes fines à l’aide d’un rasoir dans le bloc de paraffine contenant l’échantillon

*étalement et collage des coupes:

les coupes épaisses de 1 à 10 ?m sont mises à flotter sur les lames de verres dans une substances adhésive et son chauffés : dilatation et adhésion

*déparaffinage avant coloration :

-dissolution de la paraffine dans du toluène ? réhydratation préalable des coupes dans des baines d’alcool de degré décroissante.

Parfois la fixation et l’inclusion abîme trop le tissus ? congélation rapide et découpe après au cryostat

*coloration: utilisation de colorant (CF TP2)

*déshydratation: nouvelle déshydratation nécessaire pour la conservation Montage entre lame et lamelle dans une résine(Baume du Canada ou Eukitt)

c)quelques microscopes photonique particuliers :

le microscope à fond clair=microscope de base ? transformé par ajout d’accessoires particuliers

=>problème : Perte/altération des composants cellulaires au cours de la préparation ? observation de cellule vivante ? -lumière orientation

-changement de phase de densité de l’échantillon

-le microscope à fond clair=orientation de la lumière

a)microscope à fond noir :

-ajout d’un système d’obturation partielle+ miroirs : les rayons lumineux ne traversent pas directement les objets.

-les zones de la préparation qui diffusent la lumière (dispersée) seront brillants, alors que le fond de la préparation apparaître noirs.

-améliore la vision des contrastes.

b)microscope à contraste de phase (à contraste d’interférence différentielle)

-changement de phase: Interférence ? -f (densité de constituants de l’échantillon)

-création d’une image

=>lumière atténuée, cellule en vie, de minces préparatoires invisibles en fond clair, sans coloration : visualisation de niveaux de gris exemple: cytologie, bactériologie

c)microscope polarisant :

lumière d’éclairement=lumière polarisée ? nécessite la présence d’un polariseur entre la source lumineuses et l’objet (vibre dans la même direction par exemple la cristallographie) ? dédouble en fonction du cristal ? la lumière transmise traverse ensuite un analyseur avant de former l’image observé

d)microscope à fluorescence

-permet d’observer des objets naturellement fluorescents ou rendus fluorescents.

Les molécules fluorescentes absorbent la lumière d’onde donnée et l’émettent à ne longueur d’onde plus élevée

e) le stéréo microscope (=loupe binoculaire)

-éclairement par dessus

-pas de coupe, observation d’échantillons entiers, donc visions du relief

-ne permet qu’un faible grossissement

2)microscope électronique (ME)

a) caractéristiques générales :

système identique à celui du photonique sauf que :

-source de lumière=faisceau d’électrons, émis par un filament métallique (tungstène) porté à forte température, et accéléré dans le vide par une forte différence de potentiel. Située en haut du système

-on ne regarde pas directement l’image formé mais sa projection sur un écran

-observation de structures cellulaire et tissulaire plus fines que celles vue au microscope photonique

2 types de ME :

-le MET(à transmission):coupe ultrafines

-le MEB (à balayage):relief à la surface d’échantillons massifs

B)microscope électronique à transmission (MET)

a) description

composition du MET : CFp4

-1 canon à électronique

-1 série de « lentilles » =condensateur

-1 dispositif porte-objet (sas+ grille porte-objet)

-1 objectif=1 lentille , son réglage permet la mise au point de l’image finale

-1 lentille intermédiaire grâce à laquelle se forme l’image intermédiaire (grossissement)

-1 projecteur qui agrandi l’image intermédiaire et la projet sur un écran ? transforme 2 images électronique invisible pour l’œil humain en image photonique

-1 fenêtre d’observation : permet d’examiner l’image formée sur l’écran

-1 dispositif pour la photo/enregistrement de l’image finale

-1 système de pompe à vide: Quand le microscope fonctionne, l’intérieur doit être sous vide

b)possibilités et performance

limite de séparation:2 nm

NB :-limite de séparation du MP:0,2 ?m

-limite de séparation de l’œil humain : 0,1 mm

? gain de 50 00 fois par rapport à l’œil humain

-grossissement du MET : varie entre 1 500 et 20 000 fois

c) préparation des échantillons

-pas de lame, ni de lamelle sinon les électrons ne traversent pas

-observation des cellules vivantes impossible (contient de l’eau donc déformation et diminution du vide)

-même étape que le MP

*fixation et inclusion

-fixation plus puissants que pour le MP

-déshydratation et inclusion dans une matière plastique ex: Epon ? bloc très durs, coupe ultrafines

*confection et manipulation des coupes :

utilisation d’un ultramicrotome: couteaux en verre ou diamant ? coupe de très faible épaisseur (=0,05 ?m) et de petite surface(=1 mm²), donc très fragile ? pas de manipulation directes les coupes sont récupérées dans une cuve solidaire du couteau, rempli d’eau et qui contient de petites grilles métalliques circulaires ? les coupes viennent flotter à la surface d l’eau et sont récupérer sur les grilles. NB : les grilles de 3 mm de diamètre.

Mise en évidence des constituants cellulaires (TP 3 bio cell)

c)MEB (microscope électronique à balayage)

*principe du fonctionnement du MEB :

l’échantillon balayé par un faisceau très étroit d’électrons

? réémet des électrons secondaires qui forment une image sur l’écran de télévision

? image de la surface est fortement agrandie grâce aux lentilles du MEB

-pouvoir séparateur=7 mm

-le grandissement max utile de 10 à 100 000 fois

NB : prix 200 000$ à 1 000 000$