I. Chromatographie Liquide

1) SEC Size exclusion Chromatography

Séparation des protéines selon leur différence de taille (hydrodynamic radius). Séparation repose sur la capacité d'une protéine à pénétrer dans les pores d'une phase stationnaire (phase stat. à sélectionner selon gamme de fractionnation). (Il n'y a AUCUNE interaction chimique, donc PAS de gradient nécessaire).

utilisation de SEC : séparation protéine selon taille + pour estimer masse protéine + éliminer les sels (desalting avant une MS : évite les faux résultats avec d'autres ions qui s'affichent, protéine est éluée dans volume d'exclusion et les sels sortent + tard) + pour échanger de solvant avec un autre

2) IEC Ion Exchange Chromatography

Séparation des protéines selon leur différence de charge nette, grâce à une phase stationnaire chargée +/- , on aura des interactions électrostatiques avec les protéines.

Le facteur clé de cette IEC c'est le pH de la phase mobile (à optimiser selon pI de la protéine). ATTENTION : si pH < pI alors protéine sera cationique (+) => choisir donc un échangeur cationique = phase stationnaire sera chargée négativement (-).

Ici : très important de virer les sels (évite que les sels bloquent la protéine de ses interaction avec phase stat.) = dialyse, gel filtration ou ultrafiltration

3) HIC Hydrophobic Interaction Chromatgraphy

ATTENTION pas la même chose que reversed phase chromato.

HIC : on n'utilise JAMAIS de C18 comme phase stat. (cela serait trop hydrophobe), on utilise des C4 , C8, phenyl ...

Ici, les protéines sont séparées selon leur surface d'hydrophobicité. HIC se réalise en HAUTE teneur en tampon sel : 2M ammonium sulfate (NH4)2SO4 (pour permettre la bonne interaction entre la phase stationnaire et les plaques hydrophobes).

SALTING OUT EFFECT : haute concentration en sel permet de dégager la couche d'eau dense qui empêche les interactions protéine-phase stat.

L'eau est attirée par les ions = les sels => présence du sel augmente les interactions hydrophobes donc la rétention des protéines sur la phase stat.

Avantages de la HIC : on évite les solvants orga donc pas de dégradation de solvant.

4) RP-HPLC Reversed Phase Chromatography

Séparation des protéines selon leur différence d'hydrophobicité (différence de polarité/interaction avec la phase stationnaire apolaire de type C18). (ATTENTION ici : pas de haute concentration en sel !! + utilisation de solvant orga DIFFERENT DE HIC)

La protéine se désorbe de la surface de la phase stationnaire quand la concentration du solvant organique atteint sa valeur critique (interaction entre phase mobile /stat. privilégiée).

Phase stationnaire :

• particules < 2µm pour UPLC
• SPP : Superficially Porous Particles (core-shell = noyau-enveloppe) : AVANTAGES : résistance très faible, pas besoin de haute pression !

5) IPC Ion Pairing Chromatography (IP)

L'utilisation de réactif "ion pairing" tel que le TFA, dans la phase mobile comme additif permet la séparation de substances ioniques et très polaires sur une colonne de phase inverse.

6) HILIC Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography

Variante de la phase normale en chromato liquide de partage. Sauf qu'on a une phase stationnaire POLAIRE et des éluants-type de phase INVERSE.

Utilisation HILIC : enrichissement glycoprotéines, approche pour retenir des peptides polaires qui ne seraient pas retenus sur phase inverse, pas de problème de signal suppression, grande sensibilité quand couplée avec ESI-MS (comparée à RP-HPLC).

7) IMAC Immobiliazed Metal Affinity Chromatography

Repose sur la différence d'affinité d'une protéine avec un métal. On bloque, immobilise le métal sur phase stat. Sert à purifier / séparer des protéines type histidine tagged qui ont une affinité avec métal (interaction NON covalente).

8) Affinity Chromatography

La chromato d'affinité sert à purifier les protéines ciblées (targeted proteins) dans un échantillon. Basée sur une interaction spécifique entre la protéine cible et un ligand.