Page 2 sur 63OBJECTIFS Citer les étapes de la phase pré-analytique en virologie. Différencier les méthodes du diagnostic direct et indirect des infections virales Décrire les principales techniques du diagnostic direct et indirect des infections virales.
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Page 3 sur 63PLAN I- Introduction II- Phase pré-analytique en virologie III- Techniques du diagnostic virologique direct IV-Techniques du diagnostic virologique indirect Conclusion
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Page 4 sur 63I- Introduction Diagnostic virologique consiste à identifier le ou les virus responsable d’une infection virale. Le principe est de chercher le ou les marqueurs prouvant l’implication d’ un virus dans une infection donnée Les marqueurs viraux recherchés sont de deux types: M. directs: virus en entier ou un de ses composants (antigènes, génome) M. indirects: ce sont les marqueurs de la réponse immunitaire contre l’infection virale (Anticorps)
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Page 5 sur 63Diagnostic virologique I- Introduction
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Page 6 sur 63Diagnostic virologique : intérêt majeur en pratique médicale Diagnostique: c’est la confirmation de l’infection virale Thérapeutique: traitement adapté et suivi de son efficacité Prophylactique: permet de prendre des mesures préventives I- Introduction
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Page 7 sur 63PLAN I- Introduction II- Phase pré-analytique en virologie III- Techniques du diagnostic virologique direct IV-Techniques du diagnostic virologique indirect V- Conclusion
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Page 8 sur 63Comme son nom l’indique; la phase pré-analytique regroupe toutes lés étapes qui précédent la phase analytique Prescription Réalisation du prélèvement Acheminement au laboratoire Réception et vérification de conformité Enregistrement de la demande d’analyse Traitement pré-analytique du prélèvement Conservation Toutes ces étapes sont sous la responsabilité du biologiste. II- Phase pré-analytique en virologie
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Page 9 sur 63Prescription médicale+++ c’est une demande d’analyse prescrite à un malade par son médecin traitant, elle est porte deux volets d’information: Volet administratif Identité du patients , Âge du patient Coordonnées du prescripteur ... Volet médical Nature de la demande d’analyse Motif de la demande: renseignement cliniques Nature du prélèvement et condition de réalisation Date et heure du prélèvement II- Phase pré-analytique en virologie
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Page 10 sur 63Prélèvements: Conditions de réalisation: Respecter et appliquer les mesures d’asepsie +++ Rassurer et expliquer au patient la nature du prélèvement à réaliser Préparer le matériel nécessaire selon le type de prélèvement à faire La nature du prélèvement à réaliser dépend de plusieurs facteurs Virus recherché, Localisation de l’ infection (neurologique, pulmonaire, digestif, cutanéo-muqueux…) Stade de l’infection: aigue, chronique, réactivation Age du patient, … Le prélèvement doit être riche en cellules les virus sont des parasites intracellulaire obligatoires II- Phase pré-analytique en virologie
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Page 11 sur 63Exemples de recommandations pré-analytique en virologie: Liquide céphalo-rachidien LCR Flacon stérile 2h à T° ambiante +4°C durant les 24h Congélation -20 Autres - cutanéo-muqueux - liquide amniotique, - humeur aqueuse - placenta…..
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Page 12 sur 63Les échantillons doivent être bien identifiés et mis dans un emballage étanche pour éviter toute contamination Identification – conditionnement - transport -20C° Le prélèvement accompagné de la fiche de prescription doit être immédiatement acheminé au laboratoire si non, conservation : à +4C° dans les 48H au maximum pour les prélèvements destinés aux examens sérologiques et à -20C° pour les ceux destinés à la biologie moléculaire ou à la culture cellulaire II- Phase pré-analytique en virologie
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Page 13 sur 63PLAN I- Introduction II- Phase pré-analytique en virologie III- Techniques du diagnostic virologique direct IV-Techniques du diagnostic virologique indirect V- Conclusion
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Page 14 sur 63III-Techniques du diagnostic direct
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Page 15 sur 63III-1 Techniques du diagnostic direct Détection du virus ou de ses composants Isolement du virus: Cultures cellulaires et ECP Visualisation du virus: Microscopie électronique Détection des Ag viraux +++: Techniques immunologique : Ag soluble: ELISA et apparentés, Immunochromatographie; bandelette Ag associé aux cellules; Immunocytodiagnostic: Détection du génome virale +++: Amplification génique, PCR et apparenté Détection et /ou quantification du génome viral Séquençage
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Page 16 sur 63III-Techniques classiques du diagnostic direct 1. Culture cellulaire C’est un ensemble de techniques de biologie utilisées pour faire croître des cellules hors de leur organisme (in vitro) Les virus ne sont cultivables que sur des cellules vivantes (parasites intracellulaires obligatoires) Cette condition est assurée sur des : Animaux vivant (souris…) Œufs de poule : actuellement réservés pour la production de vaccins Cellules en culture: c’est la base de la culture cellulaire actuellement Il n y a pas de cellules de culture universelle : chaque virus a son tropisme particulier
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Page 17 sur 63Type de cellules origine Cellules primaires Cellules d’organes: - Rein de singe - lymphocytes humaines Durée de vie limitée : une à deux générations Cellules en lignées continues +++++ cellules transformées : immortelles - Humaines: Hela (cancer du col de femme) - Animales: Vero: cellules de rein de singe MDCK (Madin-Darby canine kidney): rein de chien MDBK: cellules de rein de bovin nombre infinie de subcultures Cellules fibroblastiques embryonnaires humaines cellules obtenues du tissus fœtaux (fœtus) Quarantaine de générations III-Techniques classiques du diagnostic direct 1. Culture cellulaire
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Page 18 sur 63III-Techniques classiques du diagnostic direct 1.Culture cellulaire: composition du milieu de culture cellulaire Cellules Eléments nutritifs, facteurs de croissances, antibiotiques….
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Page 19 sur 63III-Techniques classiques du diagnostic direct 1.Culture cellulaire Après inoculation du virus sur une culture de cellules, Incubation à 37°C en atmosphère humide (qqh à ++jours) Observera en microscope optique à faible grossissement : Absence de réplication virale: cellules non permissives Présence de réplication virale : effet cytopathique : c’est le résultat de la réplication virale entrainant des altérations morphologiques sur la culture cellulaire.
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Page 20 sur 63III-Techniques classiques du diagnostic direct 1.Culture cellulaire
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Page 21 sur 63L’identification du virus après culture cellulaire fait appel aux techniques immunologiques et moléculaires: Elle consiste à rechercher des Ag et/ou des acides nucléiques viraux Différentes techniques sont utilisées immunofluorescence /Ac monoclonaux (HSV1/HSV2) séroneutralisation / Ac polyclonaux (sérotypes de poliov) inhibition de l’hémaglutination (Adéno) amplification génomique III-Techniques classiques du diagnostic direct 1.Culture cellulaire
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Page 22 sur 63III-Techniques classiques du diagnostic direct 1.Culture cellulaire Avantages de la CC c’est la technique de référence pour le diagnostic permet l’étude phénotypique de la sensibilité aux antiviraux Permet la description de nouveaux virus Permet l’élaboration des vaccins et des antiviraux Limites de la CC Technique longue (plusieurs jours d’incubation) Difficile : nécessite du personnel expérimenté et des locaux adaptés Couteuse
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Page 23 sur 63Permet d’observer directement les virus au sein du prélèvement L’utilisation des Antisérums dirigés contre le virus suspecté facilite la détection des virus sous forme d’agrégats, c’est l’immuno-microscopie. Limites: Appareillage couteux, Technique ne permet pas la distinction entre les virus de la même famille Limitée à certains laboratoires spécialisés III-Techniques classiques du diagnostic direct 2.Microscopie électronique (ME)
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Page 24 sur 63Les techniques des recherche des Ag viraux sont basées sur l’utilisation des Ac monoclonaux qui forment des complexe immuns avec les Ag recherchés Les Ac monoclonaux sont marqués par un marqueurs facilitant leur révélation ou détection III-Techniques classiques du diagnostic direct 3.Recherche des Antigènes viraux
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Page 25 sur 63Selon la nature du marqueur utilisé on distingue techniques d’immunofluorescence (IF): utilisent un fluorochrome (fluorescéine) , La présence du virus se traduit par une fluorescence (vert-pomme) intracellulaire après excitation par des UV, c’est l’IF directe techniques immuno-enzymatiques (ELISA) : le marqueur utilisé est une enzyme (peroxydase ou autre) techniques d’agglutination sur microparticules de latex ou sur bandelette III-Techniques classiques du diagnostic direct 3.Recherche des Antigènes viraux
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Page 26 sur 63III-Techniques classiques du diagnostic direct 3.Recherche des Antigènes viraux 3-1: Techniques d’immunofluorescence (IF) ▪ L’Ac spécifique de l’Ag est marqué par un fluorochrome (fluorescéine) ▪ Lecture sous microscope à fluorescence ▪ La présence du virus se traduit par une fluorescence vert-pomme intracellulaire L’IF peut être directe (IFD) ou indirecte (IFI) IFD: la molécule indicatrice est fixée sur l’Ac Indirecte: IFI: molécule indicatrice fixée sur un deuxième Ac qui reconnait un premier Ac non marqué
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Page 27 sur 633-1: Techniques d’immunofluorescence (IF) III-Techniques classiques du diagnostic direct 3.Recherche des Antigènes viraux Exemple d’application: recherche des Ag des virus respiratoire
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Page 28 sur 63III-Techniques classiques du diagnostic direct 3.Recherche des Antigènes viraux 3-2: Techniques immuno-enzymatiques (ELISA et apparentés) Principe : l’Ag recherché est détecté par un Ac marqué par une enzyme qui après ajout de son substrat entrainera le formation d’un produit coloré (réaction colorimétrique) L’intensité de la coloration (densité optique DO) mesurée par un spectrophotomètre est proportionnelle à la quantité d’Ag existante dans le prélèvement.
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Page 29 sur 63Avantages Technique automatisée Microplaques 96 puits (adaptées aux grande série d’échantillon) Rapide: résultat obtenu en 1 à 3 heures Sensible et spécifique Exemple d’application: recherche de l’Ag Hbs du Virus de l’hépatiteB, recherche de l’Ag p24 du VIH 3-2: Techniques immuno-enzymatiques (ELISA et apparentés) III-Techniques classiques du diagnostic direct 3.Recherche des Antigènes viraux
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Page 30 sur 63III-Techniques classiques du diagnostic direct 3-Recherche des Antigènes viraux 3-3: Techniques d’agglutination sur microparticules de latex Microparticules sensibilisés par des Ac spécifiques qui en présence de l’Ag recherché vont s’agglutiner L’agglutination est visible à l’œil Exemple: recherche des Ag de Rotavirus dans les selles
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Page 31 sur 63III-Techniques classiques du diagnostic direct 3-Recherche des Antigènes viraux 3-4: Techniques immunochromatographiques: test rapide principe l’Ag recherché est prit en sandwich par un ac spécifique préalablement fixé sur une bandelette de nitrocellulose et un 2eme ac spécifique marqué à l’or colloïdal
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Page 32 sur 63III-Techniques classiques du diagnostic direct 3-Recherche des Antigènes viraux 3-4: Techniques immunochromatographiques: test rapide Avantages Rapide: résultat en 15 mn Facile à réaliser Moins couteux Limites: faible sensibilité ( faux négatif) Exemple d’application: Ag HBs Ag du virus grippal
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Page 33 sur 63III-Techniques du diagnostic direct 4-Détection du génome viral Pourquoi la biologie moléculaire? Limites de la sérologie et de la culture virale: Virus de culture lente, difficile ou non cultivable Prélèvement pauci-virologiques Ex: LCR; manque de sensibilité de la culture et des tests sérologiques Quantification de la charge virale pour le pronostic et le suivi des infections chroniques traitées ou non traitées Découverte de nouveaux virus …
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Page 34 sur 63Extraction des acides nucléiques Extraction des acides nucléiques: ADN ARN Manuelle ou automatisée Sur colonnes ou billes magnétiques A partir du sang total, plasma, LCR, prélèvements respiratoires, urines - Etapes de l’extraction: Lyse membrane cellulaires, nucléaires, enveloppe et capsides virales Libération et adsorption de l’ADN / ARN Purification de l’ADN/ARN et élimination des protéines et autres acides nucléiques Elution ADN/ARN viral # III-Techniques du diagnostic direct 4-Détection du génome viral
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Page 35 sur 63Plusieurs techniques automatisables PCR: Polymérase Chain Reaction +++ Kary Mullis: Prix Nobel d’Invention PCR 1993 Amplification génique in vitro de l’ADN : Amplification de l’ADN initial Un cycle PCR comporte trois étapes: Dénaturation- hybridation-élongation Répétition des cycles 30 à 40 cycle par PCR # III-Techniques du diagnostic direct 4-Détection du génome viral Amplification des acides nucléiques
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Page 36 sur 63Amplification automatisée des acides nucléiques cibles: ADN+++ Enzyme: ADN polymérase ADN dépendante Bactérie thermophile; Thermus acquaticus Taq (Résiste aux températures élevées) Deux amorces spécifiques du brin d’ADN: Hybridation avec le segment d’ADN correspondant Sens et anti-sens; encadrent le segment à amplifier Une sur le brin positif, l’ autre sur le brin négatif Autres réactifs: Nucléotides triphosphates; dNTP: A,T,C,G Tampon réactionnel: Mg Volume réactionnel final : 20 à 50 µl Thermocycleur: Platine chauffante/refroidissante Automate assurant une variation rapide de température 3 6
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Page 37 sur 631- Dénaturation ≈ 92°C Réactifs: -Taq polymérase (Thermus acquaticus) -Deux amorces spécifiques du brin d’ADN sens et anti-sens -dntp : réactionnel: -Tampon Mg ADN à amplifier 2- Hybridation ≈ 55°C 3-Elongatio n ≈ 70°C 1 Cycle d’amplification ≈2 mn #
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Page 38 sur 63Amplification et détection en temps réel du signal fluorescent Possibilité de quantification en temps réel: Charge virale en UI/ml; Log d’UI/ml ou en copies /ml et log copies/ml. #
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Page 39 sur 63 Variantes PCR temps réel: RT-PCR (virus à ARN), retrantranscription préalable de L’ARN en ADNc #
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Page 40 sur 63 Principe: # Déterminer l’enchaînement des nucléotides d’un fragment d’ADN grâce à une réaction de polymérisation de l’ADN avec une ADN polymérase et des didésoxyribonucléosides (ddNTP) Séquencage par la méthode de Sanger, Nextgeneration sequencing NGS Intérêt: Génotypage possible de tous les virus ; intérêt épidémiologique Génotypage de l’HPV; intérêt pronostic, HPV oncogènes Etude génotypique des résistances aux antiviraux (HIV, INFLUENZA)
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Page 41 sur 63La PCR a révolutionné le diagnostic virologique: # Rapide / détection directe à partir des prélèvements Sensibles / Prélèvements pauci-viraux Spécifiques / gène virale recherché Détection des virus non ou difficilement cultivables Automatisation et disponibilités des trousses de diagnostic in vitro Limites: Cout; complexité variable Absence de preuve du caractère infectieux du virus
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Page 42 sur 63# Diagnostic précoce avant séroconversion : ex VIH, VHC , VHB Primo-infection clinique Sécurité transfusionnelle ( Diagnostic génomique viral) Virologie moléculaire « multiplexe » virus respiratoires virus neurotropes Suivi thérapeutique: Quantification de la charge virale : Risque de transmission : VIH, VHC, VHB ... Prédiction de l’efficacité thérapeutique VHC,VIH
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Page 43 sur 63Isolement du virus: Cultures cellulaires Visualisation du virus: Microscopie électronique Détection des Ag viraux: Techniques immunologique Détection du génome virale: Amplification génique, PCR et apparenté Séquençage Diagnostic direct Détection du virus ou de ses composants Diagnostic d’une infection aigue ou chronique Détermination du statut immunitaire Différentes techniques: Techniques immunologiques: immuno-enzymatiques; ELISA et apparentés +++ Autres: Diagnostic indirect Détection des Ac anti- viraux: Ig G et Ig M # Techniques virologiques en pratique médicale courante
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Page 44 sur 63PLAN I- Introduction II- Phase pré-analytique en virologie III- Techniques du diagnostic virologique direct IV-Techniques du diagnostic virologique indirect V- Conclusion
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Page 45 sur 63 IV- Techniques du diagnostic virologique indirect Définition Le DI consiste à mettre en évidence des Anticorps spécifiques (Immunoglobulines) témoins d’une réaction immunitaire humorale développée au cour d’une infection virale récente ou ancienne. Structure de l’immunoglobuline
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Page 46 sur 63Mise en évidence des Ac synthétisés en réponse à une infection virale: IgM : marqueurs d’une infection aiguë ou récente IgG : marqueurs d'une infection passée ou ancienne (état immunitaire) Intérêt du diagnostic indirect IV- Techniques du diagnostic virologique indirect
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Page 47 sur 63Principe Le diagnostic indirect (DI) repose sur la spécificité de la réaction Ag-Ac; On utilise un ou plusieurs antigènes viraux comme moyen de de formation des complexes immuns Ag-Ac avec les Ac spécifiques recherchés, Les antigènes viraux utilisés peuvent être : virus entier purifié protéines virales extraites ou recombinantes oligopeptides synthétiques IV- Techniques du diagnostic indirect Deux catégories de techniques de DI peuvent être distinguées
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Page 48 sur 63IV- Techniques du diagnostic indirect 1-Techniques ne permettant pas de distinguer l’isotype des Anticorps Techniques d’inhibition de l’hémagglutination
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Page 49 sur 63IV- Techniques du diagnostic indirect 1-Techniques ne permettant pas de distinguer l’isotype des Anticorps Technique d’inhibition de l’hémagglutination
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Page 50 sur 63IV- Techniques du diagnostic indirect 2- Techniques permettant de distinguer l’isotype des Anticorps Ces techniques utilisent un deuxième Ac spécifique permettant de déterminer la classe des immunoglobulines (Ac) humaines détectées: IgM –IgG- IgA ou Ig totales. Ce sont les plus utilisées en diagnostic indirect Principe : basé sur la fixation d’un Ag viral sur un support solide Le sérum à tester est mis en contact avec l’Antigène Après une étape de lavage, un Ac anti-Ig humaine est ajouté Cet Ac est couplé à un système de révélation qui détermine le type de la technique
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Page 51 sur 63Selon la nature du marqueur utilisé, on distingue différentes techniques Fluorochrome dans le cas de l’immunofluorescence indirect Radio-isotope dans le cas des techniques radio-immunologiques Enzyme spécifique d’un substrat : tech. immuno-enzymatiques IV- Techniques du diagnostic indirect 2- Techniques permettant de distinguer l’isotype des Anticorps
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Page 52 sur 63Dominées actuellement par les techniques ELISA et apparentés Avantages: Rapides, sensibles, spécifiques automatisables Résultats qualitatifs et quantitatifs Distinguent les Ig M et les Ig G IV- Techniques du diagnostic indirect 2- Techniques permettant de distinguer l’isotype des Anticorps
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Page 53 sur 63Enzyme (paroxydase ou autre) qui après ajout de son substrat il y aura production d’un produit coloré, l’intensité de la couleur mesurée par un spectrophotomètre sera proportionnelle à la quantité des Ac recherchés : 2-2: Techniques immuno-enzymatiques (ELISA et apparentés) IV- Techniques du diagnostic indirect 2- Techniques permettant de distinguer l’isotype des Anticorps
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Page 54 sur 63IV- Techniques du diagnostic indirect 2- Techniques permettant de distinguer l’isotype des Anticorps
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Page 55 sur 63Détection des IgM Ac anti IgM (Ac monoclonal de souris) fixé sur phase solide Fixation des IgM recherchées Ag correspondant conjugué à l’enzyme Ex: IgM anti CMV, Rubéole, HBc ELISA immunocapture: permet la détection des IgM
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Page 56 sur 63ELISA combinée ou mixte IV- Techniques du diagnostic indirect 2- Techniques permettant de distinguer l’isotype des Anticorps Consiste à rechercher l’antigène et l’Anticorps spécifiques d’un virus en une seule réaction ELISA Applications: VIH: Ag p24 + Ac anti VIH VHC: Ag capsidique + Ac anti VHC
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Page 57 sur 63IV- Techniques du diagnostic indirect 2- Techniques permettant de distinguer l’isotype des Anticorps elle permet de vérifier la spécificité des Anticorps vis-à -vis des antigènes d’un virus donné Avantages : ils sont plus spécifiques que les techniques ELISA Application en virologie : confirmation d’une sérologie positive exp: infection à VIH Technique de Western blot
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Page 58 sur 63Principe Mise en culture du virus (exp : VIH) Préparation d’un lysat de culture (suspension d’antigènes viraux) Séparation par électrophorèse sur gel de polyacrylamide des antigènes (protéines et ou glycoprotéines) virales Transfert des protéines virales spécifiques sur une bandelette de nitrocellulose Ajouter le sérum à tester et révélation de la réaction Ag-Ac par méthode colorimétrique (ELISA sur bandelette) IV- Techniques du diagnostic indirect 2- Techniques permettant de distinguer l’isotype des Anticorps Technique de Western blot
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Page 59 sur 63Réaction ELISA Sur la bandelette Technique de Western blot
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Page 60 sur 63IV- Techniques du diagnostic indirect Intérêts du diagnostic indirect
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Page 61 sur 63IV- Techniques du diagnostic indirect limites du diagnostic indirect
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Page 62 sur 63Conclusion - Le diagnostic virologique a une place importante en pratique médicale Le diagnostic virologique est orienté par les données clinico-biologiques: Permet de définir les prélèvements et les examens les plus adaptés La conformité de la phase pré-analytique: Prélèvement, transport et conservation des prélèvements est indispensable pour l’analyse et l’interprétation des résultats L’ interprétation du diagnostic virologique repose sur la confrontation entre les données cliniques et biologiques et la collaboration étroite entre cliniciens et virologues
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