= déterminer l'ordre d'enchaînement des nucléotides pour un fragment d'ADN donné

Technique de Sanger

Principe :

• brin a séquencer (avec une orientation inverse par rapport au sens de lecture conventionnel)
• séquençage selon Sanger met en oeuvre une ADN polymérase
• nécessité de disposer d'une amorce nucléotidique : donc de connaître la séquence du fragment contigu de celui à séquencer

-> principe du séquençage

• faire fabriquer par l'ADN polymérase tous les brins complémentaires possibles du brin à séquencer
• du plus court au plus long possible
• à partir de l'extrémité 3' de l'amorce puisqu'elle ajoute des nucléotides de 5' vers 3'
• on attend autant de séquences que le nombre de briques blanches
• les ordonner par taille (+ petit au + grand)
• identifier le dernier nucléotide mis en place sur l'extrémité 3'

-> pour satisfaire aux points 1 et 3 il faut :

• être capable de stopper la synthèse des brins complémentaires de manière aléatoire, sur chaque nucléotide ajouté par la polymérase
• être capable de déterminer la nature de ce nucléotide

solution : réaliser la réaction en présence d'un didésoxyribonucléotide

-> groupement OH absent contrairement à un désoxyribonucléotide classique

• dans le dNTP : groupement OH permet l'accrochage du nucléotide suivant par l'ADN polymérase
• si elle ajoute un ddNTP elle ne peut pas ajouter de nucléotide suivant car pas de groupement OH = la séquence s'arrête

-> lorsqu'une ADN polymérase utilise un ddNTP au lieu d'un dNTP, elle n'est plus capable de rajouter le moindre nucléotide à la suite = fin de la séquence d'ADN

-> si elle ajoute un dNTP, elle ajoute des nucléotides à la suite = synthèse du brin se poursuit

-> répartition de l'ADN à séquencer en 4 tubes

-> en commun dans les 4 lots :

• amorce complémentaire
• ADN polymérase
• gène à séquencer
• dNTP

-> différences des tubes : ddNTP spécifiques

• 1er : réaction en présence de ddATP (adénine)
• 2ème : réaction en présence de ddTTp (thimine)
• 3ème : réaction en présence de ddGTP (guanine)
• 4ème : réaction en présence de ddCTP (cytosine)
• en faible concentration par rapport aux dNTP correspondants et radioactifs

-> ADN polymérase va :

• se placer à l'extrémité 3' de l'amorce et ajoute les nucléotides par complémentarité de séquence
• à le choix entre ddNTP et dNTP aléatoire

= choix aléatoire par la polymérase

= localisation aléatoire du site de blocage

= obtention de tous les brins possibles

piste A -> tous les fragments d'ADN néo synthétisés se terminent par un "A"

piste T -> tous les fragments d'ADN néo synthétisés se terminent par un "T"

etc...

= sépare les fragments en fonction de leur taille -> le plus petit sera tout en bas - plus le fragment est petit + il migre loin du puits

-> réaction

• chargement du mélange de chaque réaction dans un puits de gel de polyacrylamide
• migration életrophorétique
• révélation par autoradiographie car ddNTP radioactifs
• lecture du gel de séquence, des fragments les plus courts vers les fragments les plus longs -> donc de 5' en 3' selon le sens conventionnel de lecture des séquences
• on obtient donc la séquence 5'-P -> 3'-OH du brin néosynthétisé

-> on réalise la séquence complémentaire et antiparallèle pour obtenir la séquence en blanc

Remarques :

• si on compare les 4 tubes entre eux : il n'y a jamais 2 fois la même taille de fragment
• les fragments migrent d'autant plus vite que leur masse moléculaire est faible
• la lecture se fera de 5' vers 3' en commençant par les fragments les plus petits pour accéder à la séquence du brin néosynthétisé par l'ADN polymérase