Manipulation des protéines
Définition
Lyse cellulaire
La lyse cellulaire est une étape essentielle dans la manipulation des protéines. Elle permet de rompre la membrane cellulaire et d'extraire les protéines intracellulaires. Il existe différentes méthodes de lyse cellulaire, parmi lesquelles on peut citer la lyse chimique, la lyse mécanique/physique, etc.
1. Lyse chimique :
La lyse chimique consiste à utiliser des agents chimiques pour rompre la membrane cellulaire. Ces agents peuvent être des détergents, des solvants organiques ou des réactifs spécifiques. L'avantage de cette méthode est sa simplicité d'utilisation et sa rapidité. Cependant, elle peut altérer certaines protéines sensibles aux agents chimiques.
2. Lyse mécanique/physique :
La lyse mécanique/physique consiste à utiliser des forces physiques telles que l'homogénéisation, la sonication ou l'utilisation de billes de verre pour rompre la membrane cellulaire. Cette méthode permet de préserver les protéines intactes, mais elle peut être plus longue et plus délicate à mettre en œuvre.
1. Electrophorèse de protéines :
L'électrophorèse de protéines est une technique qui permet de séparer les protéines en fonction de leur taille et de leur charge électrique. Il existe plusieurs types d'électrophorèse de protéines, dont l'électrophorèse native et l'électrophorèse dénaturante, notamment le SDS-PAGE.
- a. Principe général :
L'électrophorèse consiste à appliquer une différence de potentiel électrique à travers un gel contenant les protéines à séparer. Les protéines se déplacent alors en fonction de leur charge électrique, leur taille et leur forme.
- b. Electrophorèse native :
L'électrophorèse native est utilisée pour séparer les protéines en préservant leur conformation native. Les protéines sont mélangées à un tampon sans agent dénaturant avant d'être chargées sur le gel. Cette technique est notamment utilisée pour étudier les complexes protéiques et leurs interactions.
- c. Electrophorèse dénaturante : le SDS-PAGE :
L'électrophorèse dénaturante, également appelée SDS-PAGE, utilise un agent dénaturant appelé SDS (dodécylsulfate de sodium) pour dénaturer les protéines. Le SDS confère une charge négative aux protéines et les déroule en une structure linéaire. Cette technique permet de séparer les protéines uniquement en fonction de leur taille.
2. Visualisation spécifique d'une protéine : le Western Blot :
Le Western Blot est une technique utilisée pour détecter et quantifier une protéine spécifique dans un mélange complexe. Les étapes principales du Western Blot sont la séparation des protéines par électrophorèse et leur transfert sur une membrane, la détection de la protéine cible à l'aide d'un anticorps spécifique et la visualisation du signal grâce à une réaction chimique.
- a. Principe général :
Le Western Blot repose sur la spécificité de liaison entre un anticorps et une protéine cible. L'anticorps est généralement conjugué à une enzyme qui catalyse une réaction chimique produisant un signal détectable.
- b. Les étapes majeures :
Les étapes majeures du Western Blot sont la séparation des protéines par électrophorèse, le transfert des protéines sur une membrane (transfert de Western), le blocage de la membrane pour éviter les liaisons non spécifiques, l'incubation avec l'anticorps primaire spécifique, l'incubation avec l'anticorps secondaire conjugué à une enzyme et la révélation du signal.
- c. Lecture d'un Western Blot :
La lecture d'un Western Blot se fait généralement à l'aide d'un scanner ou d'un système de détection de fluorescence. Le signal obtenu est quantifié pour évaluer la quantité de protéine présente dans l'échantillon.
3. Microscopie :
La microscopie est une technique utilisée pour visualiser les protéines à l'échelle microscopique. Deux types de microscopie couramment utilisés sont l'immunomarquage et la fusion de protéines fluorescentes.
- a. Immunomarquage :
L'immunomarquage consiste à marquer spécifiquement une protéine d'intérêt à l'aide d'un anticorps conjugué à une sonde fluorescente. Cette technique permet de localiser la protéine dans les cellules vivantes ou fixées.
- b. Fusion de protéines fluorescentes :
La fusion de protéines fluorescentes consiste à fusionner une protéine d'intérêt à une protéine fluorescente, telle que la GFP (Green Fluorescent Protein). Cette technique permet de suivre en temps réel la localisation et les mouvements de la protéine dans les cellules vivantes.
- b. Fusion de protéines fluorescentes :
La fusion de protéines fluorescentes consiste à fusionner une protéine d'intérêt à une protéine fluorescente, telle que la GFP (Green Fluorescent Protein). Cette technique permet de suivre en temps réel la localisation et les mouvements de la protéine dans les cellules vivantes.
1. Séquencer une protéine :
Le séquençage d'une protéine consiste à déterminer l'ordre des acides aminés qui la composent. Il existe différentes méthodes de séquençage, dont le séquençage historique par dégradation d'Edman et la méthode actuelle par spectrométrie de masse.
- a. Prérequis au séquençage :
Avant de séquencer une protéine, il est nécessaire de la purifier et de la fractionner en peptides. Cette étape peut être réalisée par électrophorèse ou par digestion enzymatique.
- b. Séquençage historique : dégradation d'Edman :
Le séquençage historique des protéines se fait par dégradation séquentielle de l'extrémité N-terminale. La méthode d'Edman utilise un réactif spécifique qui permet de marquer et de détacher le premier acide aminé du peptide. Ce processus est répété plusieurs fois pour obtenir la séquence complète du peptide.
- c. Méthode actuelle : Spectrométrie de masse :
La spectrométrie de masse est une méthode plus rapide et plus sensible pour séquencer les protéines. Elle consiste à ioniser les peptides et à mesurer leur rapport masse/charge. Les peptides sont ensuite fragmentés et les masses des fragments sont utilisées pour déduire la séquence des acides aminés.
2. Déterminer la structure :
La détermination de la structure d'une protéine permet de comprendre sa fonction et ses interactions. Trois méthodes couramment utilisées sont la cristallographie aux rayons X, la résonance magnétique nucléaire (RMN) et la cryo-microscopie électronique (Cryo-EM).
- a. Cristallographie aux rayons X :
La cristallographie aux rayons X consiste à faire diffracter un faisceau de rayons X par un cristal de protéine. Les données de diffraction sont collectées et utilisées pour résoudre la structure tridimensionnelle de la protéine.
- b. Les autres méthodes : RMN et Cryo-EM :
La RMN permet de déterminer la structure d'une protéine en solution. Elle repose sur l'analyse des interactions entre les noyaux atomiques d'une protéine et les molécules d'eau. La Cryo-EM utilise un faisceau d'électrons pour prendre des images de la protéine dans son environnement naturel. Ces images sont ensuite utilisées pour reconstruire la structure tridimensionnelle de la protéine.
- b. Les autres méthodes : RMN et Cryo-EM :
La RMN permet de déterminer la structure d'une protéine en solution. Elle repose sur l'analyse des interactions entre les noyaux atomiques d'une protéine et les molécules d'eau. La Cryo-EM utilise un faisceau d'électrons pour prendre des images de la protéine dans son environnement naturel. Ces images sont ensuite utilisées pour reconstruire la structure tridimensionnelle de la protéine.
A retenir :
Résumé final :
La manipulation des protéines comprend différentes étapes, notamment la lyse cellulaire, la visualisation des protéines, la caractérisation des protéines et la détermination de leur structure. La lyse cellulaire permet d'extraire les protéines des cellules, tandis que l'électrophorèse de protéines permet de les séparer en fonction de leur taille et de leur charge électrique. Le Western Blot est utilisé pour détecter une protéine spécifique, tandis que la microscopie permet d'observer les protéines à l'échelle microscopique. Le séquençage des protéines permet de déterminer leur séquence d'acides aminés, tandis que la détermination de leur structure permet de comprendre leur fonction et leurs interactions.
